【地方标准】 O型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法

DB21/T2252-2014 O型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法 发布单位：辽宁省质量技术监督局 发布日期：2014-03-07 实施日期：2014-05-07 1 范围 本标准规定了O型口蹄疫病毒（FMDV-0）RT-PCR检测方法的实验材料、仪器设备、试剂、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。本标准适用于动物及动物产品中O型口蹄疫病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件： GB/T6682-1992 分析实验室用水规格 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准： DEPC：二乙烯基烯基化合物，用于去除核酸中的RNA酶。 RNA：核糖核酸。 RT-PCR：反转录聚合酶链反应。 dNTP：脱氧核糖核酸三磷酸。 bp：碱基对。 4 原理 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种通过反转录酶将RNA转录为cDNA，再利用聚合酶链反应扩增特定基因序列的方法。FMDV是一种RNA病毒，通过该方法可以检测到FMDV-O保守基因序列。 5 实验材料、仪器设备和试剂 5.1 实验材料 眼科剪、眼科镊、称量纸、1.5mL灭菌离心管（经DEPC水处理）、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500mL量筒、500mL三角瓶、吸头（10μL、200μL、1000μL）。 5.2 仪器设备 分析天平、低温高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、70℃冰箱、微波炉、组织矿磨器、20℃冰箱、可调移液器（最大量程分别为2μL、20μL、200μL、1000μL）。 5.3 试剂 5.3.1 2.5mmol/L dNTP 5.3.2 引物：上游引物5'-AGATTTGTGAAAGTAACACCA-3'，下游引物5'-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3'. 5.3.3 10倍PCR缓冲液。 5.3.4 1%溴化乙锭（EB）溶液。 5.3.5 电泳缓冲液（50倍）。 5.3.6 1%琼脂糖凝胶。 5.3.7 75%乙醇。 5.3.8 灭菌DEPC水。 5.3.9 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。 5.3.10 反转录酶（如AMV逆转录酶）。 5.3.11 聚合酶（如Taq DNA聚合酶）。 6 操作步骤 6.1 样品的采集、保存、运送和处理 6.1.1 样品采集 6.1.1.1 水泡液：未破裂水泡中的水泡液用灭菌注射器吸取后装入灭菌小瓶中，可加青霉素1000UI/mL，链霉素1mg/mL，加盖密封，编号。 6.1.1.2 水泡皮：剪取新鲜水泡皮3~5g放入灭菌小瓶中，加6~10mL（2倍体积）50%磷酸盐缓冲液（0.04mol/L，pH 7.4），加盖密封，编号。 6.1.1.3 肌肉或组织样品：无菌采集淋巴结、脊髓、肌肉等组织样品，3~5g装入洁净的小瓶内或其他灭菌容器，编号。 6.1.1.4 O-P液样品：被检动物在采样前禁食12小时（可饮水），避免反胃内容物污染O-P液。采样前探杯应经0.2%柠檬酸或2%氢氧化钠浸泡5分钟，并用自来水冲洗干净。采样时动物应站立保定，将探杯送入食道上部10~15cm处，轻轻来回移动2~3次，然后将探杯拉出。如O-P液污染，使用生理盐水冲洗后重新采样。 6.1.2 样品保存与运送 6.1.2.1 样品保存：采集的样品应冷藏送检或尽快冷冻保存，避免反复冻融。 6.1.2.2 样品运送：样品应装入保温容器中进行运送，保持适当温度。