【地方标准】 沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术

DB37/T 2794—2016
沙门氏菌（猪霍乱、鼠伤寒）环介导等温扩增检测技术
Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella typhimurium and Salmonella choleraesuis

ICS 11.220 B41
山东省地方标准
发布：2016-07-29
实施：2016-08-29
山东省质量技术监督局发布

前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。
本标准由山东省农业科学院提出，由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。
起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。
主要起草人：黄保华、时建立、李俊、彭喆、刘畅、朱荣生、徐绍建、丛晓燕、杜以军、吴家强、孙文博。

1 范围
本标准规定了鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）的环介导等温扩增（LAMP）检测技术要求。
本标准适用于疑似污染鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的各类样品检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡注日期的引用文件，仅该日期版本适用；凡不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 4789.4—2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验

3 材料
3.1 器材
3.1.1 微量移液器（10μL、20μL、100μL、1000μL）
3.1.2 20000g低温高速离心机
3.1.3 电热恒温水槽
3.1.4 稳流稳压电泳仪
3.1.5 水平电泳槽
3.1.6 凝胶成像系统
3.1.7 紫外透射反射分析仪
3.1.8 电磁炉
3.1.9 1000mL烧杯

3.2 试剂
3.2.1 5 mol/L Betaine溶液（见附录A.1）
3.2.2 Bst DNA Polymerase（8U/μL）
3.2.3 SYBR Green I核酸染料
3.2.4 0.5×TBE缓冲液（见附录A.2）
3.2.5 1%琼脂糖电泳液（见附录A.3）
3.2.6 10 mg/mL溴化乙锭（EB）水溶液
3.2.7 DNA Marker 2000
3.2.8 超纯水（符合GB/T 6682要求）

3.3 引物
鼠伤寒沙门氏菌LAMP检测引物：
F3：5'-CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG-3'
B3：5'-CGTGAGATATCGTCCAAAAGG-3'
FIP：5'-GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC-3'
BIP：5'-AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC-3'

猪霍乱沙门氏菌LAMP检测引物：
F3：5'-GGAGGAAGGTAGGGATGACG-3'
B3：5'-CACTCCCATGGTGTGACG-3'
FIP：5'-TCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTT-CCCTTACGACCAGGGCTA-3'
BIP：5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCGA-GGAACGTATTCACCGTGGC-3'

4 方法
4.1 样品处理及DNA提取
样品前处理及增菌按GB 4789.4—2010中5.1、5.2操作。取1mL增菌液置于1.5mL EP管中，10000r/min离心2min，弃上清；加入灭菌生理盐水1mL混匀后再次离心；再加入灭菌双蒸水1mL混匀，沸水浴煮沸10min，立即冰浴冷却5min，12000rpm离心3min，取上清作为DNA模板，-20℃保存备用。

4.2 环介导等温扩增（LAMP）操作流程
4.2.1 LAMP反应体系
按表1顺序配制反应体系。

4.2.2 LAMP程序设定
每次扩增均设置阴性对照（以超纯水作为模板），具体参数见表2。