【地方标准】 小麦土传病毒病病原检测技术规程

DB32/T4395—2022
小麦土传病毒病病原检测技术规程
Code of practice for detection of pathogen of soil-borne wheat viral diseases

前言
DB32/T4395—2022
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省作物标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：江苏省农业科学院、宁波大学、江苏省植物保护植物检疫站。本文件主要起草人：周彤、羊健、杜琳琳、朱凤、周益军。

1 范围
本文件规定了小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒检测原理、设备和试剂、间接酶联免疫吸附剂测定、斑点酶联免疫吸附剂测定及RT-PCR测定方法。本文件适用于小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的检测。

2 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1 小麦黄花叶病
wheat yellow mosaic disease
小麦的一种土传病毒病，自然界中由禾谷多黏菌（Polymyzagraminis）在土壤中传播，病原为小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus）。
2.2 中国小麦花叶病
Chinese wheat mosaic disease
小麦的一种土传病毒病，自然界中由禾谷多黏菌（Polymyragraminis）在土壤中传播，病原为中国小麦花叶病毒（chinese wheat mosaic virus）。

缩略语
CWMV：中国小麦病毒（Chinese Wheat Mosaic Virus）
Dot-ELISA：斑点酶联免疫吸附剂测定（Dot Enzyme-linked Immunosorbent Assay）
ELISA：酶联免疫吸附剂测定（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）
间接ELISA：间接酶联免疫吸附剂测定（Indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
RT-PCR：逆转录-聚合酶链式扩增反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）

4 原理
4.1 间接ELISA原理
将酶分子与抗体共价结合，得到同时具有免疫活性和酶的生物活性的酶标抗体。检测时，将已知的抗体吸附在固相载体表面，若受检样本中含有相应的抗原，则会与固相载体上的抗体发生特异性结合从而随之固定在固相载体上，然后洗涤除去未结合及多余的其他蛋白，再加入酶标抗体，使其与吸附在固相载体上的抗原特异性结合。最后加入酶反应底物，底物被酶催化出现颜色反应产生有色产物。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与受检样品中抗原的量呈正比，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
4.2 Dot-ELISA原理
硝酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下可有效地吸附蛋白质等生物大分子，并保持其免疫活性。将抗原吸附在硝酸纤维素膜表面，利用膜作为固相载体进行抗原抗体反应，通过与相应的抗体和酶标抗体的一系列免疫反应，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，加入酶反应的底物后，底物被催化出现颜色反应产生有色物质并沉着于抗原抗体复合物吸附的部位，呈现出肉眼可见的斑点。可通过肉眼观察斑点的出现与否和颜色深浅程度判定受检样品中是否存在特定抗原及其浓度。
4.3 RT-PCR原理
将逆转录（RT）和聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。逆转录是在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成与之互补的DNA（complementary DNA, cDNA）的过程，再利用特异性引物以cDNA为模板在DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，依据是否能扩增出目的片段大小的PCR产物进行结果判定。

5 设备和试剂
5.1 设备
酶标仪、洗板机、微量天平、台式离心机、水浴锅、冰箱、-80℃低温冰箱、磁力搅拌器、高压灭菌锅、微量移液枪、96孔酶标板、硝酸纤维素膜、培养皿、冰盒、紫外分光光度计、PCR仪。
5.2 试剂
间接ELISA的检测试剂，按照附录A。
Dot-ELISA的检测试剂，按照附录B。
RT-PCR的检测试剂，按照附录C。
除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。
5.3 对照
田间采集疑似小麦黄花叶病和中国小麦花叶病的小麦病株，采用附录C中的特异性引物进行RT-PCR检测。得到的扩增产物长度为124bp的小麦样品则认定为感染WYMV的阳性样品，得到的扩增产物长度为182bp的小麦样品则认定为感染CWMV的阳性样品；没有出现目的产物的小麦植株叶片则认定为阴性样品。阳性样品和阴性样品存放于-80℃低温冰箱。
间接酶联免疫吸附剂测定和斑点酶联免疫吸附剂测定中，样品提取缓冲液作空白对照；RT-PCR检测中以无菌水作为空白对照。

6 间接ELISA
6.1 取样
田间剪取待测样品叶片，锡箔纸包裹后放入冰盒中。
6.2 样品制备
待检测样品按1:10（克:毫升）加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000 r/min离心3min，上清液即为制备好的检测样品。对照样品做相同处理。
6.3 加样
在96孔酶标板上加入6.2制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照及样品提取缓冲液，每孔加样100μL，加盖，37℃孵育1h或4℃冰箱孵育过夜，每个样品重复3次。
6.4 洗板
孵育结束后，用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PBST）清洗酶标板3~5次。每孔每次加PBST洗液700μL，每次停留1min~2min。
6.5 加抗血清
用相应病毒抗血清和抗体稀释缓冲液按照1:2000的比例稀释，每孔加入稀释好的抗体液100μL，加盖，37℃孵育1.5h。
6.6 洗板
同6.4。
6.7 加酶标抗体
用抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100μL/孔，加盖，37℃孵育1.5h。
6.8 洗板
同6.4。
6.9 加底物缓冲液
将配好的底物缓冲液按100μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育15min~30min。
6.10 终止反应
加入50μL终止液/孔。
6.11 读数
6.12 结果判定
6.12.1 首先读取对照孔的OD值（缓冲液、阴性对照、阳性对照），应该在质量控制范围内：缓冲液孔的OD值<0.15；阴性对照孔的OD值<0.15（当阴性对照孔的OD值<0.05时，按0.05计算）；阳性对照有明显的颜色反应，且阳性对照OD值/阴性对照OD值>2。
6.12.2 在满足了6.12.1质量控制要求后，可根据如下数据判断结果：
1. 样品OD值/阴性对照OD值 > 2，判为阳性；
2. 样品OD值/阴性对照OD值 < 0.5，判为阴性；
3. 样品OD值/阴性对照OD值在1.5~2.0之间，判为可疑，样品需重新检测一次，或用其他方法验证。