【地方标准】 马铃薯X病毒检验鉴定技术规程

DB51/T1210—2011 马铃薯X病毒检验鉴定技术规程 前言 本标准分为范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂与材料、仪器及用具、取样、实验室检验、结果判断、样品保存等部分。本标准由四川省农业厅提出并归口，起草单位为四川省植物检疫站。主要起草人包括宁红、郭迪金、谭家兴、谢成伦、万佳、熊玉兰、杨重渝。 1 范围 本标准规定了马铃薯X病毒（见附录A）的取样、实验室检验、结果判断及样品保存的技术要求和方法，适用于马铃薯感染马铃薯X病毒的检验和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB15569-2009 农业植物调运检疫规程 DB51/T868-2009 马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒检验鉴定技术规程 3 术语和定义 3.1 目标条带：根据某种病毒RNA序列中一段保守的、特异的碱基序列设计特异引物，通过RT-PCR扩增和电泳检测得到的与引物设计长度吻合的RT-PCR扩增条带。目标条带的存在，是判断某种病毒存在的标准。本标准中PVX的目标条带为625bp。 4 原理 马铃薯X病毒通过蚜虫和农事操作传播，远距离传播主要通过人为的引种、商品流通等途径，带毒块茎和种苗是该病毒远距离传播的主要载体。该病毒具有潜隐性，通常难以通过病害症状确定。采用免疫学和分子生物学方法，可快速进行马铃薯X病毒的检验鉴定。 5 试剂与材料 5.1 免疫学检验试剂 免疫学检验试剂包括： 1. 捕捉抗体：马铃薯X病毒免疫球蛋白，抗体稀释度按市售产品要求进行，贮藏于4℃条件下备用； 2. 酶标抗体：用碱性磷酸酶标记的马铃薯X病毒免疫球蛋白抗体，按市售产品要求稀释，贮藏于4℃条件下备用； 3. 包被缓冲液：取2.93g碳酸氢钠（NaHCO3）、1.59g碳酸钠（Na2CO3）、0.2g叠氮化钠（NaN3），用1000mL蒸馏水溶解，并调pH值到9.6，贮藏于4℃备用； 4. 洗涤液：取1.15g无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）、0.2g氯化钾（KCl）、0.2g无水磷酸二氢钾（KH2PO4）、8.0g氯化钠（NaCl）、0.5g吐温-20，用1000mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4； 5. 样品提取液：取1.3g无水硫酸钠（Na2SO4）、20.0g聚乙烯吡咯烷酮（C6H9NO）24-40000、0.2g叠氮化钠（NaN3）、2.0gⅡ级鸡蛋清白蛋白粉、20.0g吐温-20，用1000mL洗涤液溶解，并调整pH值到7.4，贮藏于4℃备用。 6 仪器及用具 实验室常规设备，包括移液器、试管、离心机、电泳仪、温控设备等。 7 取样 根据标准取样程序，确保取样过程中的样品代表性和完整性。 8 实验室检验 使用免疫学和分子生物学方法（如DAS-ELISA和RT-PCR）进行马铃薯X病毒的检验。实验操作需严格按照标准程序进行，确保结果准确。 9 结果判断 根据RT-PCR条带的大小、免疫反应结果等指标判断是否感染马铃薯X病毒。 10 样品保存 样品应在适当条件下保存，以保证其在后续检验中不受污染或变质。 附录A（资料性附录） 马铃薯X病毒基本信息 附录B（资料性附录） 马铃薯X病毒DAS-ELISA检验程序 附录C（资料性附录） 马铃薯X病毒RT-PCR检验程序