【地方标准】 克氏原螯虾白斑综合征诊断和防控技术规程

ICS 65.150
CCS B 52
DB51
四川省地方标准
DB51/T 3065-2023
克氏原螯虾白斑综合征诊断和防控技术规程
2023-06-19 发布
2023-08-01 实施
四川省市场监督管理局 发布

前言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。
本文件起草单位：四川农业大学。
本文件主要起草人：黄小丽、耿毅、陈德芳、欧阳萍。
本文件为首次发布。

1 范围
本文件规定了由白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）引起的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）白斑综合征的诊断、预防、治疗及病死虾处理等要求。
本文件适用于克氏原螯虾白斑综合征的诊断以及四川行政区域内稻田和池塘养殖克氏原螯虾白斑综合征的防控。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 11607 渔业水质标准
GB/T 28630.2-2012 白斑综合征（WSD）诊断规程 第2部分：套式PCR检测法
NY/T 5361 无公害农产品 淡水养殖产地环境条件
SC/T 7014 水生动物检疫实验室技术规范

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
克氏原螯虾白斑综合征 white spot syndrome of Procambarus clarkii
由白斑综合征病毒感染引起的克氏原螯虾发病或死亡的一种病毒性疾病。

4 诊断
4.1 试剂和材料
4.1.1 试剂
检验中所需试剂的配制按照GB/T 28630.2-2012和SC/T 7014的规定进行。Taq MasterMix、10×PCR缓冲液（无Mg2+）、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司供应的商品化试剂。除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂。
4.1.2 水
应符合GB/T 6682中一级水的规格，且用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水。
4.1.3 引物
外侧引物：
F1: 5'-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3'
R1: 5'-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3'
用来扩增WSSV DNA的1447 bp产物，-20℃保存。
内侧引物（套氏引物）：
F2: 5'-GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA-3'
R2: 5'-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3'
用来从第一步PCR扩增的1447 bp产物中再扩增出941 bp的产物，-20℃保存。
内参引物：
F3: 5'-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3'
R3: 5'-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3'
扩增十足类动物DNA中848 bp的片段产物，-20℃保存。

4.2 设备与器械
设备和器械应当符合GB/T 28630.2-2012的规定。

4.3 临床检查
4.3.1 临床症状
患病克氏原螯虾主要临床症状为体色变暗、摄食减少、反应迟钝、活力较差。
4.3.2 剖检
患病克氏原螯虾内脏器官大体病变不典型，主要表现为部分肠段中空无食物，肠壁透明，肠管较细；头胸甲易剥离，剥开头胸甲后部分病虾可在头胸甲与肌肉之间的膜上见到大量白色斑点。其余器官如肝胰腺、鳃等无明显变化。

4.4 实验室样品采集
样品采集按GB/T 28630.2-2012中附录B的规定执行。

4.5 DNA提取
4.5.1 样品准备
4.5.1.1 活体或冰冻的仔虾及幼虾个体样品（去虾眼）约0.1 g；活体或冰冻的成虾鳃、心脏、肝胰腺、肠、步足、游泳足等组织样品约0.1 g。
4.5.1.2 将上述待检样品用生理盐水洗去血污，剪碎，放入灭菌后的1.5 mL离心管中，后用匀浆器将样品均浆成糊状，避免各样品间的交叉污染。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗，然后浸于新配制的75%酒精中5 min，无菌水充分清洗两次后，方可使用。
4.5.2 提取DNA
样品DNA提取按照GB/T 28630.2-2012中6.3的规定执行。
4.5.3 微量分光光度计测定核酸浓度和纯度
4.5.3.1 在上样孔处点入1.5 μL无菌水，点样时不要有气泡残留，对仪器进行校准。
4.5.3.2 校准完成后，用擦镜纸将无菌水擦干净，之后点入1.5 μL待测样品，盖上样品盖，对待测样品进行核酸浓度和纯度的测定。合格的双链DNA的A260/A280应在1.7～1.9之间，若比值偏高说明提取的DNA中有RNA残留，若比值较低说明有蛋白质残留。

4.6 DNA提取质量及体系监控
使用内参引物F3和R3，按照GB/T 28630.2-2012中6.4的规定进行样品提取质量及反应体系监控。

4.7 套氏PCR操作
（注：原文此处截断，后续内容未提供）

附录A（资料性）
白斑综合征病毒基因参考序列