【地方标准】 玉米转基因成分筛查方法

DB12/T505—2014《玉米转基因成分筛查方法》发布于2014年4月22日，实施日期为2014年7月20日。本标准由天津市质量技术监督局提出，天津市东丽区产品质量监督检验所与天津市农业质量标准与检测技术研究所起草，主要起草人包括黄凤军、李建、赵新、陈杰、易萌、朱珠、马强、杨炳存。 1 范围 本标准规定了玉米中转基因成分定性PCR筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述，适用于玉米及其制品中SSIIb内标准基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt基因、bar基因、HPT基因的定性PCR筛查检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T672 转基因植物及其产品检测通用要求 农业部2031号公告—19-2013 转基因植物及其产品检测抽样 农业部1485号公告—4-2010 转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化 3 术语和定义 3.1 SSIIb基因：编码玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2的基因。 3.2 CaMV35S启动子：来自花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子。 3.3 NOS终止子：来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子。 3.4 Bt基因：来源于苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常见的Bt基因包括crylAc基因、crylAb基因、crylAb/crylAc融合基因。 3.5 bar基因：来源于土壤吸水链菌（Streptomyces hygroscopicus），编码膦丝菌素乙酰转移酶（PAT），该酶具有对除草剂草丁麟（glufosinate）的耐受性。 3.6 HPT基因：来源于大肠杆菌或链球菌（Streptomyces hygroscopicus），编码潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase）的基因。 4 检测方法 4.1 试剂和材料 实验用水为重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。 4.1.1 琼脂糖 4.1.2 10g/L溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭（EB），溶于100mL水中，避光保存。溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。 4.1.3 10mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容到200mL。 4.1.4 500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.3），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液调pH至8.0，定容至100mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。 4.1.5 1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。 4.1.6 TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.5）和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.4），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。 4.1.7 50×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.4），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1XTAE。 4.1.8 加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝。