【GA公共安全标准】 法庭科学生物检材中唑吡坦气相色谱、气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱检验方法

ICS13.310
中华人民共和国公共安全行业标准GA/T1327—2016
法庭科学生物检材中唑吡坦气相色谱、气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱检验方法
GC,GC-MS and LC-MS/MS examination methods for zolpidem in biologicalsamplesinforensicscience
2016-09-14发布
中华人民共和国公安部
2016-09-14实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。GA/T1327—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/TC179/SC1）提出并归口。
本标准起草单位：公安部物证鉴定中心、北京市公安局法医检验鉴定中心、山西医科大学法医学院。本标准主要起草人：张蕾萍、杜鸿雁、栾玉静、于忠山、何毅、王芳琳、乔静、杨士云、张文芳、负克明、王玉瑾、尉志文。
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1范围
法庭科学生物检材中唑吡坦气相色谱、气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱检验方法
GA/T1327—2016
本标准规定了法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾等）中唑吡坦的气相色谱（GC）、气相色谱-质谱（GCMS)和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检验方法。本标准适用于法庭科学生物检材中唑吡坦的定性及定量分析。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法GA/T122毒物分析名词术语
3术语和定义
GA/T122
界定的术语和定义适用于本文件。4原理
以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩后，采用气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法检测，以保留时间（t）、质谱特征离子碎片峰和相对丰度作为定性判断依据：与平行操作的添加标准物质响应值比较，根据峰面积之比，用外标法进行定量分析。
5试剂和材料
除另有说明外，本标准所用试剂均为分析纯，试验用水为一级水（见GB/T6682一2008规定）：a）二氯甲烷；
b）乙酸乙酯；
c）硼砂；
d）磷酸二氢钠；
e）磷酸氢二钠
f）氢氧化钠；
甲醇：色谱纯；
h）乙腈：色谱纯；
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GA/T1327—2016
甲酸：色谱纯：
乙酸铵：色谱纯：
k）pH=6磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（NazHPO,·12HzO)8.812g，磷酸二氢钠（NaH,PO：2H,0)27.37g，加人一定量的水溶解并稀释至1000mL；1
pH=10硼砂-氢氧化钠缓冲液：称取硼砂(NazB.O,·10H2O)2.38g，氢氧化钠（NaOH)0.86g，加人一定量的水溶解并稀释至500mLm）0.1%甲酸5mmol/L乙酸铵溶液：称取乙酸铵（CH，COONH）0.192g，加人一定量的水溶解，并加人0.5mL甲酸，混匀，加水稀释至500mL；n）标准溶液：
1）1.0mg/mL标准物质溶液：称取唑吡坦标准物质50.0mg于50mL容量瓶中，加人一定量甲醇溶解并稀释至刻度，混勾。配制成1.0mg/mL的唑吡坦标准物质溶液。密封，置于冰箱中冷冻保存。保存时间6个月；2）100.0μg/mL标准工作溶液：移取1.0mg/mL的唑吡坦标准物质溶液1.0mL于10mL容量瓶中，加人甲醇稀释至刻度，混匀。配制成100.0μg/mL的唑吡坦标准工作溶液。密封，置于冰箱中冷藏保存。保存时间3个月。试验中所用其他浓度的标准工作溶液均由1.0mg/mL标准物质溶液用甲醇稀释得到。o）固相萃取柱：OasisHLB柱或等效固相萃取柱；注：OasisHLB柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。P）pH试纸：范围1～14；
q）微孔有机滤膜：0.22μm；
6仪器和设备
仪器和设备包括：
a）气相色谱仪：配氮磷检测器（NPD)：b）气相色谱-质谱联用仪：配电子轰击源（EI）；液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器；c
电子天平：分度值为0.1mg
离心机；
涡旋振荡器！
浓缩器；
h）科
移液器。
7操作方法
7.1定性分析
7.1.1样品萃取
7.1.1.1样品制备
移取血液、尿液等液体样品1.0mL~5.0mL，或称取碎的肝脏等组织样品1.0g~5.0g于具盖离心管中。另取等量相同基质的空白样品3份于具盖离心管中，一份作为空白样品，另两份分别添加唑吡坦标准物质0.5μg（采用液相色谱-串联质谱法时，添加唑吡坦标准物质0.05μg）作为添加样品，混匀，2
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待检。
7.1.1.2液液萃取
GA/T1327—2016
取7.1.1.1待检样品，分别加入一定量的硼砂-氢氧化钠缓冲液调节至pH=9pH=10，混匀，再加人二氯甲烷或乙酸乙酯5mL~10mL，振荡10min，8000r/min离心10min，提取有机相；重复提取一次，合并两次提取的有机相，在浓缩器上50℃下浓缩至干，残渣加人甲醇50μL～100μL定容，转移至进样瓶内，供气相色谱和气相色谱-质谱联用仪分析。若供液相色谱-串联质谱仪分析，则残渣加人甲醇200μL～1000μL定容，用微孔有机滤膜过滤并转移至进样瓶内供仪器分析。7.1.1.3固相萃取（适合于新鲜的液体检材）取7.1.1.1待检样品，分别加人pH=6的磷酸盐缓冲液5mL~10mL，混勾，超声15min，8000r/min以上离心20min，取上清液过固相萃取柱（先依次用甲醇3mL，水3mL活化），控制流速为0.5mL/min～1.0mL/min；再用5%甲醇-水（体积比为5：95）3mL淋洗；再用二氧甲烷4mL洗脱，收集洗脱液在浓缩器上50℃下浓缩至干，残渣加人甲醇50μL～100μL定容，转移至进样瓶内，供气相色谱和气相色谱-质谱仪分析。若供液相色谱-串联质谱仪分析，则残渣加人甲醇200～1000L定容，用微孔有机滤膜过滤并转移至进样瓶内，供仪器分析。7.1.2仪器检测
7.1.2.1气相色谱仪条件
以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a）色谱柱：DB-1毛细色谱柱（或其他100%-聚二甲基硅氧烷等效柱），30m×0.32mm×0.25μm；注：DB-1毛细色谐柱是Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。色谱柱温程：200℃保持1min，以10℃/min速率升温至280℃，保持10minb）有
c）进样口温度：280℃
d）检测器温度：300C；
载气：氨气，纯度大于99.999%；分流比：5：1~50：1
g）柱流量：1.0mL/min~2.0mL/min。气相色谱-质谱仪条件
以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：色谱柱：DB-1MS毛细色谱柱（或其他100%-聚二甲基硅氧烷等效柱），30mX0.32mm×a)
注：DB-1MS毛细色谱柱是Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b）色谱柱温程：100℃保持2min，以15C/min速率升温至280℃，保持17min；进样口温度：280℃；
d）传输线温度：230℃；
e）离子源温度：200℃；
载气：氧气，纯度大于99.999%；f
柱流量：1.0mL/min~2.0mL/min
h）分流比：5：1~50：1
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质量扫描范围：40amu~450amu；扫描方式：全扫描（SCAN)。
液相色谱-串联质谱仪条件
以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)
色谱柱：ZORBAXEclipsePlusCis反向色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm）或其他等效柱；注：ZORBAXEclipsePlusCs柱为Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)
流动相及梯度洗脱条件：见表1；扫描方式：正离子扫描（ESI+）：检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：5500kV；
离子源温度：650℃C；
雾化气压力：55psi；
气帘气压力：30psi；
辅助气压力：50psi；
定量离子对、去簇电压、碰撞能：见表2。表1流动相和梯度洗脱条件
唑吡坦
保留时间
记录和计算
mL/min
流动相A
（含0.1%甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液）90%
表2定量离子对、去簇电压、碰撞能定量离子对
308.1>235.0
定性离子对
308.1>235.0
308.1>263.0
去簇电压
流动相B
（乙睛）
碰撞能量
记录各样品及标准物质平行进样2次～3次中相应目标物的tR及峰面积值，按式（1)计算回收率：A±×W×V±×100%
式中：
回收率
添加样品中标准物质的峰面积平均值；标准物质浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；..
........(1)
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V添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）；A—标准物质的峰面积平均值；
添加样品中标准物质的添加量，单位为微克（ug）。7.2定量分析
7.2.1样品萃取
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移取血液等液体样品1.0mL~5.0mL或称取铰碎的组织样品1.0g~5.0g两份；另取等量相同基质的空白样品两份，分别添加唑吡坦标准物质（添加量应与案件样品粗测量相近），混匀。按7.1.1进行平行操作。
仪器检测
按7.1.2进行检测。
记录与计算
7.2.3.1计算药物含量
记录各样品平行进样2次～3次中相应目标物的峰面积值，按式（2)计算含量：W
式中：
AXMXV样
AXM样XV
-单位质量案件样品中目标物质的含量，单位为微克每克（ug/g）或微克每毫升（μg/mL）；案件样品中目标物的峰面积平均值；一添加样品中标准物质的添加量，单位为微克（μg）；V样一案件样品的定容体积，单位为毫升（mL）：一添加样品中目标物的峰面积平均值；A
案件样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL）；V一一添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）。7.2.3.2计算相对相差
记录两份平行操作的案件样品含量，按式（3)计算相对相差：(1x1-Xl×100%
RD=一
式中：
相对相差（%）；
两份案件样品平行定量测定的含量数值；x
8结果评价免费标准bzxz.net
一两份案件样品平行定量测定含量的平均值。8.1定性结果评价
8.1.1阴性结果评价
（3）
如果案件样品未出现与标准物质te相同的色谱峰，添加样品的回收率大于等于60%，则阴性结果5
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可靠。
如果添加样品中未出现与标准物质t相同的色谱峰或回收率小于60%，则阴性结果不可靠。应按7.1重新提取检验。
如果在气相色谱法中添加样品的添加含量小于或等于0.2ug/mL时或液相色谱-串联质谱法中添加含量小于或等于0.01μg/mL时，可不计算回收率，则阴性结果按以下方式评价：a）如果案件样品未出现与标准物质tr相同的色谱峰，添加样品的色谱峰信噪比大于10，则阴性结果可靠；
b）如果添加样品中未出现与标准物质t相同的色谱峰或添加样品的色谱峰的信噪比小于等于10，则阴性结果不可靠。应按7.1重新提取检验。8.1.2阳性结果评价
气相色谱法的阳性结果需用气相色谱-质谱法或液相色谱-串联质谱法进行确证。如果案件样品与标准物质t比较，t偏差在士2.5%之内，且质谱特征离子碎片（或定性离子对）与添加样品中的相对丰度比之相对误差不超过表3规定的范围，空白样品无干扰，则阳性结果可靠。相关图谱参见附录A中图A.1图A.4。唑吡坦中毒资料参见附录B。如果空白样品出现与标准物质t相同的色谱峰，且质谱特征离子碎片（或定性离子对）及相对丰度一致，则阳性结果不可靠。应按7.1重新提取检验。表3定性确证时相对离子丰度的最大充许偏差相对离子丰度
20%~50%
10%~20%
≤10%
8.2定量结果评价
允许的相对偏差
如果案件样品中目标物含量的RD小于或等于20%，定量数据可靠，其含量按两份案件样品的平均值计算。生物样品中唑吡坦检出限参见附录A中表A.1。如果案件样品中目标物含量的RD大于20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。to
A.1气相色谱图
唑吡坦的气相色谱图见图A.1。
UV(X100000)
气相色谱-质谱图
附录A
（资料性附录）
唑吡坦的相关谱图及数据
Z80\E/10z
图A.1唑吡坦气相色谱图（t=13.0min）唑吡坦的相关气相色谱-质谱图见图A.2、图A.3。(X1000000)
Inten.(x10 000)
081699/22
唑吡坦的总离子流图（t=12.7min）235
191205
唑吡坦的质谱图（m/z=235236307）13.0
GA/T1327—2016
GA/T1327—2016
液相色谱-串联质谱提取离子流图唑吡坦的液相色谱-串联质谱提取离子流图见图A.4。XIC of-MRM(2pmirs)
XIC afMR
308.100/235.000 Dafror
100/235.000
Sample a3(sample) of feiben
ehiwTurt
wilTurboSpray
mple33(sumpie)of leibeng-cesh.n
ARM(2pairs) 308. 100 / 253.000 Da fromSample 33(sanple) of feibeng-ceshiwitf TurbeSpruyimefmint
2.62.83.03.2
图A.4唑吡坦的液相色谱-串联质谱提取离子流图（tx=1.66min）A.4检测限
生物检材中唑吡坦检测限见表A.1。生物检材中唑吡坦的检测限
气相色谱法
0.05μg/mL
检出限
气相色谱法-质谱法
0.1 μg/mL
ax.4t5.ops
Miax.1.esops
iax5.7e4op5
液相色谱-串联质谱法
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