【GA公共安全标准】 生物样品中Y-羟基丁酸的气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱检验方法

ICS13.310
中华人民共和国公共安全行业标准GA/T1074—2013
生物样品中-羟基丁酸的气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱检验方法GC-MS and LC-MS/MS examination methods for -hydroxybutyric acid inbiologicalsamples
013-06-28发布
中华人民共和国公安部
2013-06-28实施
中华人民共和国公共安全
行业标准
生物样品中-羟基丁酸的气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱检验方法GA/T1074——2013
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2013年12月第一次印刷
2013年12月第一版
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本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。GA/T1074—2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/TC179/SC1）提出并归口。
本标准起草单位：司法部司法鉴定科学技术研究所。本标准主要起草人：刘伟、沈敏、沈保华、向平、卓先义。I
1范围
生物样品中-羟基丁酸的气相色谱质谱和液相色谱-串联质谱检验方法GA/T1074—2013
本标准规定了生物样品中Y-羟基丁酸（Y-hydroxybutyricacid，简称GHB）的气相色谱-质谱（GCMS)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检验方法。本标准适用于生物样品（血液、尿液、组织及毛发)中GHB的定性及定量分析。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682--2008分析实验室用水规格和试验方法GA/T122毒物分析名词术语
3术语和定义
GA/T122界定的术语和定义适用于本文件。4原理
4.1气相色谱-质谱法原理
样品加人酸性氯化铵饱和溶液调节pH值小于4，以GHB-d为内标，用乙酸乙酯提取，离心后取有机层，水浴下吹干，残留物经N,O-双（三甲基硅烷基）二氟乙酰胺（BSTFA)或N-特丁基二甲基硅烷基N-甲基-三氟乙酰胺（MTBSTFA)衍生化后，用气相色谱-质谱仪测定。经与平行操作的GHB对照品比较，以保留时间和质谱特征碎片离子进行定性分析；以峰面积为依据，内标-校准曲线法定量。1.2液相色谱-串联质谱法原理
样品加人酸性氯化铵饱和溶液调节pH值小于4，以GHB-d。为内标，用乙酸乙酯提取，离心后取有机层，水浴下吹干，残留物中加人流动相进行溶解，用液相色谱-串联质谱仪测定。经与平行操作的HB对照品比较，以保留时间和两对母离子/子离子对进行定性分析，以峰面积为依据，内标-校准曲线去定量。
试剂、仪器和材料
.1试剂
本标准所用试剂除另有规定外均为分析纯，试验用水为一级水（见GB/T6682一2008规定）：a）甲醇。
GA/T1074—2013
乙酸乙酯。
氯化铵。
浓盐酸。
氢氧化钠。
丙酮。
十二烷基磺酸钠。
乙睛：色谱纯。
甲酸：质量分数50%，优级纯。
乙酸胺：优级纯。
N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：三甲基氯硅烷（TMCS）=99：1。N-特丁基二甲基硅烷基-N-甲基-三氟乙酰胺（MTBSTFA）。0.1moL/L氢氧化钠溶液：称取0.4g氢氧化钠至100mL试剂瓶中，加100mL水溶解。氯化铵饱和溶液：室温下将氯化铵充分溶解于水中，直至饱和。1mol/L盐酸溶液：吸取8.3mL浓盐酸至100mL容量瓶中，加水稀释、定容至刻度。o
2mol/L盐酸溶液：吸取16.6mL浓盐酸至100mL容量瓶中，加水稀释、定容至刻度p)
pH=4的氯化铵饱和溶液：用1mol/L盐酸溶液将氯化铵饱和溶液的pH值调至4。q
0.1%十二烷基磺酸钠溶液：称取0.1g十二烷基磺酸钠至100mL试剂瓶中，加100mL水溶解。
流动相缓冲溶液（20mmol/L乙酸胺和0.1%甲酸溶液）：称取1.54乙酸铵和1.84g甲酸置s)
于1000mL容量瓶中，加入水溶解、定容至刻度，pH值约为4。流动相：乙睛+流动相缓冲溶液（85+15）。GHB对照品：纯度在大于等于98%。u)
GHB对照品溶液配制：精密称取GHB对照品适量，用甲醇配成1mg/mL的标准储备溶液，v)
冰箱中冷冻保存，保存期为12个月。试验中所用其他浓度的标准溶液均从上述储备溶液用甲醇稀释而得，保存时间为3个月。w）内标物GHB-d。对照品溶液配制：市售尔代内标GHB-d。的甲醇溶液浓度为1mg/mL，置于冰箱中冷冻保存。试验中所用其他浓度的标准溶液均从上述储备溶液用甲醇稀释而得，保存时间为3个月。
2仪器和材料
仪器和材料包括：
气相色谱-质谱仪：配有电子轰击源（EI）：a)
液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器；b）
分析天平：感量0.1mg；
涡旋混合器；
离心机；
恒温水浴锅：
精密移液器：
空气泵；
球磨机；
微波炉；
具塞离心试管。
6检验
6.1定性分析
6.1.1样品处理
6.1.1.1血液、尿液预处理
GA/T1074—2013
取血液（尿液）样品100μL置于具塞离心试管中，加人内标GHB-d。1μg，再加人0.5mLpH=4的氯化铵饱和溶液后，混勾，加乙酸乙酯3mL，祸旋混合2min，3000r/min离心3min，将上层转移到另一离心试管中，于35℃水浴中空气流下吹干。6.1.1.2组织预处理
将组织样品剪碎后称取100mg，加人内标GHB-d。1μg，再加人1mL氯化铵饱和溶液，在室温条件下浸泡30min后，吸取0.2mL于具塞离心试管中，用1mol/L盐酸溶液调至pH值为4，加乙酸乙酯3mL，涡旋混合2min，3000r/min离心3min，将上层转移到另一离心试管中，于35℃水浴中空气流下吹干。
6.1.1.3毛发预处理
毛发样品依次用0.1%十二烷基磺酸钠溶液、水和丙酮振荡洗涤，晾干后剪成约1mm段或用球磨机磨碎。
准确称取50mg已剪碎或磨碎毛发，加人内标GHB-dg500ng，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液0.5mL，于90℃水浴中水解45min。冷却后加1滴2mol/L盐酸溶液，使其pH值小于4，然后加乙酸乙酯3mL，涡旋混合2min。3000r/min离心3min，将上层转移到另一离心试管中，于35℃水浴中空气流下吹干。
6.1.1.4衍生化反应（供气相色谱-质谱仪分析）血液、尿液、组织、毛发等样品经以上预处理后，获得的残留物中加人20μL乙睛和20μLBSTFA（血液、尿液、组织）或20μLMTBSTFA（毛发），微波炉（750w)中衍生化4min或于70℃烘箱中衍生化15min，冷却后供气相色谱-质谱仪分析。6.1.1.5直接定容（供液相色谱-串联质谱仪分析）血液、尿液、组织、毛发等样品经以上预处理后，获得的残留物中用100μL流动相定容，供液相色谱-申联质谱分析。
6.1.2添加样品及空白样品
取空白血液100μL、尿液100μL、组织100mg、毛发50mg各两份，一份添加GHBds内标液0.5μg1μg和GHB0.01μg~0.05μg（血液0.1μg/mL、尿液0.1μg/mL组织0.2μg/g、毛发1μg/g）作为检测限添加样品，一份做空白样品，按上述操作与案件样品平行提取和分析。6.1.3仪器条件
6.1.3.1气相色谱-质谱参考条件以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同性状样品实际情况进行调整：3
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色谱柱：HP-5MS柱（30mX0.25mm×0.25μm）或等效色谱柱。b)
载气：氨气，纯度≥99.999%。
流速：1.0mL/min。
柱温：60℃保持2min。以30℃/min速率升温至280℃，保持10min。进样体积：1μL。
进样方式：分流进样，分流比10：1。进样口温度：250℃。
接口温度：280℃。
离子源温度：230℃。
定性分析：采用全扫描（Full Scan）方式GHB及内标GHB-d。的BSTFA衍生化物和MTBSTFA衍生化物的特征碎片离子、定量离子分别见表1和表2。
表1GHB和GHB-d。的BSTFA行生化物的特征碎片离子和定量离子名称
GHB的BSTFA衍生化物
GHB-ds的BSTFA衍生化物
特征碎片离子
233,234,235
239,240,241
定量离子
表2GHB和GHB-d。的MTBSTFA衍生化物的特征碎片离子和定量离子名称
GHB的MTBSTFA衍生化物
GHB-d。的MTBSTFA衍生化物
液相色谱-串联质谱仪参考条件
特征碎片离子
275,276,277
281.282,283
以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同性状样品实际情况进行调整：a
定量离子
色谱柱：Cosmosil5Cis-MS-Il(150mm×2.0mm，5μm）或等效色谱柱，前接Cis保护柱；流动相：A（乙睛）：B(20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸溶液）=85：15；流速：0.2mL/min；
进样体积：5μL：
扫描方式：负离子扫描（ESI-）：检测方式：多反应监测（MRM）：电喷雾电压：-4500V；
碰撞气：6psi；
气帘气：15psi；
离子源气1:10psi；
离子源气2：40psi;
离子源温度：400℃
GHB和GHB-d。的定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP)和碰撞能量（CE)见表3。m）
6.1.4进样
表3GHB和GHB-d。的质谱参数
定量离子对
103.0/57.1
109.1/61.1
定性离子对
103.0/57.1
103.0/85.1
109.1/61.1
109.1/90.5
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分别吸取各样品提取（浓缩）衍生化溶液或定容液、空白样品提取（浓缩）衍生化溶液或定容液、添加样品衍生化落液或定容液和GHB对照品各适量，按6.1.3仪器分析条件进样分析。记录及计算
记录各样品及GHB对照品的峰面积值，按式（1)计算回收率：R=An×WnxVe ×100%
AuXxMe
式中：
回收率；
添加样品中GHB峰面积平均值：
GHB对照品的峰面积平均值；
添加样品中GHB添加量，单位为微克（μg）：添加样品的定容体积，单何为毫升（mL）；GHB对照品质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)。6.2定量分析
6.2.1取样
取样品血液100μL、尿液100μL、组织100mg、毛发50mg各两份，加人GHB-d。内标0.5μg~1#g。同时取相同基质空白添加GHB对照品适量配制系列浓度的校准样品（参见附录A.1)，加人GHB-d。内标0.5μg～1μg。样品中GHB的浓度应在校准曲线的线性范围内。6.2.2样品处理
同6.1.1。
6.2.3仪器分析条件（参考值）
同6.1.3。
定量分析可采用选择离子监测（SIM)方式。6.2.4进样
分别吸取各样品提取（浓缩）衍生化溶液或定容液、空白样品提取（浓缩）衍生化溶液或定容液、系列浓度的校准样品衍生化溶液或定容液，按6.1.3仪器分析条件进样分析。5
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6.2.5记录
记录样品、系列浓度的校准样品中GHB及内标物GHB-d。峰面积值，然后计算含量。6.2.6计算
6.2.6.1样品中GHB含量
以GHB与内标GHB-d。定量离子（或离子对)的峰面积比(Y)为纵坐标，GHB浓度(C)为横坐标进行线性回归，得线性方程。
根据各样品中GHB及内标GHB-d。峰面积值，按式（2)计算含量：CYa
（2）
式中：
C一—样品中GHB的含量，单位为微克每毫升或微克每克（μg/mL或μg/g）；Y——样品中GHB与内标物GHB-d。定量离子(或离子对)的峰面积比；线性方程的截距；
6线性方程的斜率。
6.2.6.2相对相差
记录两份平行操作的案件样品含量，按式（3)计算相对相差RD=/X=X:1×100%
+（3）
式中：
相对相差；
X，、X?—两份案件样品平行定量测定的含量数值：x
两份案件样品平行定量测定含量的平均值。7分析结果评价
7.1定性结果评价
7.1.1阳性结果评价
气相色谱-质谱法
在相同的实验条件下，如果添加样品中出现GHB的色谱峰和特征碎片离子，空白样品中未出现相应的色谱峰，而案件样品中出现相应的色谱峰和特征碎片离子，且保留时间与添加样品中GHB的色谱峰保留时间比较，相对误差在士2%内，则阳性结果可靠。7.1.1.2液相色谱-串联质谱法
在相同的实验条件下，如果案件样品中出现两对定性离子对，其色谱峰保留时间与添加样品中GHB的色谱峰保留时间比较，相对误差在士2%内，且所选择的相对离子对丰度比与添加样品中的相对离子对丰度比之相对误差不超过表4规定的范围，空白样品中未出现相应的色谱峰，则阳性结果可靠。6
相对离子对丰度比的最大充许相对误差相对离子对丰度比
允许的相对误差
阴性结果评价
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如果空白样品中出现与标准品保留时间一致的色谱峰，且特征离子碎片（或定性离子对）及相对丰度一致，则阳性结果不可靠。如果添加样品中GHB呈阳性，且回收率在60%以上，则阴性结果可靠；如果添加样品中GHB回收率低于60%或呈阴性，则阴性结果不可靠。7.1.3线性范围和检测限
气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法中，生物样品中GHB的校准曲线线性范围和检测限参见附录A中表A.1。内源性GHB的阈值参见附录A中A.2。2定量结果评价
两份案件样品的相对相差若不超过20%，定量数据可靠，结果按两份案件样品的平均值计算。若两份案件样品的相对相差超过20%，需要重新进行测定。GA/T1074—2013
A.1线性范围和检测限
附录A
（资料性附录）
GHB检测相关数据
生物样品中GHB的校准曲线线性范围、检测限见表A.1。表A.1生物样品中GHB的校准曲线线性范围、检测限样品
血液（尿液）免费标准bzxz.net
内源性GHB的阅值
线性范围
2μg/mL~60μg/mL
10μg/g~100μg/g
1 ng/mg~75ng/mg
气相色谱-质谱法
0.05μg/ml
0.1 μg/g
人体内存在内源性GHB，尿液中GHB的阅值为10μg/mL。GA/T1074-2013
打印日期：2014年1月21HF009
检测限
液相色谱-串联质谱法
0.1μg/mL
版权专有
侵权必究
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