【SN商检标准】 国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫技术规范第8部分:实验室检测

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4346.8—2015
国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫技术规范
第8部分：实验室检测
Technical specificationfor health quarantine to the fulminating and highly fatalcontagiousdiseasesatfrontierports-Part8:Laboratorydetection2015-12-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
淘
美康
2016-07-01实施
发布
前
言
SN/T4346《国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫技术规范》分为10个部分：第1部分：总则；
第2部分：风险评估与预警；
—第3部分：风险交流；
第4部分：交通工具、货物及集装箱卫生检疫查验；第5部分：人员及行李卫生检疫查验；第6部分：境外病例转运专用包机卫生检疫；第7部分：卫生处理；
第8部分：实验室检测；
第9部分：个人防护；
第10部分：保障。
本部分为SN/T4346的第8部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4346.8—2015
本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院
本部分主要起草人：李小波、林燕如、肖利力、黄吉城、孙肖红、郑夔、师永霞、冯庆文、袁帅、毕英杰。1范围
国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫技术规范第8部分：实验室检测
SN/T4346.8—2015
SN/T4346的本部分规定了国境口岸人出境人员以接触传播为主要传播途径的烈性传染病实验室检测。实验室检测流程包括样本采集、处理，实验室检验程序、方法，结果判定及相关的生物安全要求。
本部分适用于口岸人出境人员烈性接触性传染病实验室检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法SN/T1439
马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法SN/T3558
SN/T4346.9
WS/T230
国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫技术规范第9部分：个人防护合酶链反应（PCR）技术的应用
临床诊断中聚合
人间传染的病原微生物名录
3实验室资质要求
卫生部
进行本标准规定的烈性接触性传染病检测的实验室须为通过国家CNAS认可并获得国家卫生和计划生育委员会实验活动资质认定的生物安全三级实验室。实验室生物安全应符合GB19489相关规定；聚合酶链反应（PCR)防污染措施按照WS/T230执行。4检测对象
人出境口岸疑似感染埃博拉出血热、马尔堡出血热等烈性接触性传染病的人员。5样本采集、处理
5.1由于烈性接触性传染病传染风险大，样本采集过程存在很大的生物安全风险，一般以采集患者血样为主，采样过程中应做好个人生物安全防护。一般发病14d内，可在患者血样中检测到病毒核酸和抗原；发病10d～14d后的血样中可检出特异性抗体。5.2血液样本采集：静脉采集疑似病人抗凝全血5mL。样本采集、运送人员应严格按照相关规定做好个人生物安全防护，所有使用过的消耗品均须进行严格的消毒灭菌处理SN/T4346.8—2015
5.3血液样本保存、运输：样本采集后，应于4℃以下生物安全送样箱中尽快送到有资质的实验室检测，或一70℃以下保存待检。样本保存、运输过程中须严格按照国家高致病性菌、毒种相关规定进行，个人生物安全防护详见SN/T4346.9。检测方法
6
6.13
分子生物学检测
6.1.1适用样本范围
适用于人全血样本中烈性接触性传染病病原体核酸的检测。6.1.2
主要仪器和设备
下列仪器和设备适用于本部分：生物安全柜；
高压灭菌器；
普通冰箱；
水浴锅或金属浴；
—冷冻离心机（带密封的离心安全杯，转速可达20000g）；实时荧光PCR仪
6.1.3主要试剂
下列试剂适用于本部分：
核酸提取试剂：使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒QIAampViralRNAMiniKit!\，详见说明书；
一步荧光RT-PCR反应体系构建使用AMBION公司的AgPath-IDTMOne-stepRT-PCRKit\试剂盒进行；
TRIZOL试剂。
6.1.4血液样本处理
在具备检测活动资质的实验室生物安全柜内，取100μL全血样本与1mLTRIZOL试剂轻柔颠倒混合（1：10比例），室温放置10min备用，此操作过程应尽量轻柔，严格控制生物气溶胶的产生。6.1.5RNA提取
6.1.5.1采用QIAGEN公司的病毒RNA提取试剂盒以QIAampViralRNAMiniKit，德国QIAGEN公司产品为例\，内含AVL、AW1、AW2、AVE等成分。6.1.5.2取上述作用后的标本140μL加人560μL裂解缓冲液（Lysisbuffer，AVL），在旋涡混合器上振荡15s混匀，室温静置10min。6.1.5.3加人560μL无水乙醇终止反应，在旋涡混合器上振荡15s混匀。6.1.5.4
4裂解后的液体分两次移人管柱，每次6000g离心1min，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。
1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品，2
6.1.5.5加500μL洗液（AW1)至管柱上，6000g离心1min，弃去AW1。SN/T4346.8-2015
6.1.5.6加500μL洗液（AW2）至管柱上，20000g离心3min，弃去AW2，进一步20000g离心1min以彻底去除残留在膜上的乙醇
6.1.5.7加人60μL洗脱液（AVE)，室温静置1min。6.1.5.8将管柱置于1.5mL离心管上，温度4℃，6000g离心1min，得到的RNA即可进行实时荧光RT-PCR检测。
6.1.6实时荧光PCR检测
埃博拉病毒核酸检测按照SN/T1439执行。马尔堡病毒核酸检测按照SN/T3558执行。其他病毒检测参照相应的标准执行。6.2血清学检测
6.2.1双抗体夹心法ELISA检测核蛋白抗原6.2.1.1适用样本范围
适用于人血清样本中烈性接触性传染病病原体核蛋白抗原的检测6.2.1.2
主要仪器和设备
下列仪器和设备适用于本部分：-恒温培养箱；
一含波长450nm的酶标仪；
—洗板机；
—移液器。
6.2.1.3
3主要试剂
双抗体夹心法ELISA抗原检测试剂盒。6.2.1.4样本处理
血清样本60℃灭活1h后，置于生物安全三级实验室核心工作区生物安全柜内。在洗板机废液收集桶内加人含10%有效氯的消毒剂，加人量为废液桶总体积的5%。6.2.1.5
5操作步骤
操作步骤如下(具体参照试剂盒说明书进行)：将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30min，使用前将试剂轻轻震荡混匀。a）
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
配液：将新鲜配制的洗液注入洗板机的洗液桶内。编号：将样本对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，模拟阳性对照2孔和空白对照1孔。加稀释液：每孔加稀释液20μL，空白孔除外加样：分别在相应孔中加人待测样本或阴阳性对照各100μL，空白孔除外。温育：用封板膜封板后，置37℃温育60min。加酶：每孔加酶标试剂50uL，空白孔除外，轻轻震荡混匀。温育：用封板膜封板后，置37℃温育30min，洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍3
SN/T4346.8—2015
显色：每孔加入显色剂A、显示剂B各50uL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色30mink）测定：每孔加终止液50uL，10min内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处（建议使用双波长450nm/600nm～650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。清洗、消毒洗板机：按洗板机内置程序分别采用蒸馏水、20%乙醇和75%乙醇进行清洗消毒，1）
30min后，再用蒸馏水清洗，Www.bzxZ.net
6.2.1.6结果判定
临界值计算：临界值=0.1十阴性对照组A值均值（阴性对照组A值低于0.05者以0.05计算）。阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A：阳性对照的正常值范围：A≥0.50。阳性判定：样品A值≥临界值者为病毒抗原阳性阴性判定：样品A值<临界值者为病毒抗原阴性6.2.2抗体捕捉法ELISA检测IgM抗体6.2.2.1适用样本范围
适用于人血清样本中烈性接触性传染病病原体的IgM抗体检测S
6.2.2.2主要仪器和设备
下列仪器和设备适用于本部分
恒温培养箱；
含波长450nm的酶标仪：
洗板机；
移液器。
6.2.2.3主要试剂
抗体捕捉法IgM抗体检测试剂盒。6.2.2.4样本处理
血清样本60℃灭活60min后，置于生物安全三级实验室核心工作区生物安全柜内。在洗板机废液收集桶内加人含10%有效氯的消毒剂，加入量为废液桶总体积的5%。6.2.2.5操作步骤
操作步骤如下（具体参照试剂盒说明书进行）：将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30min，使用前将试剂轻轻震荡混匀。a）
b）
配液：将新鲜配制的洗液注入洗板机的洗液桶内。c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
4
加稀释液：每孔加人样本稀释液100μL，空白及阴阳性对照孔除外。加样：在相应孔中加入待测样本10μL，轻轻振荡混匀，阴、阳性对照加100μL。温育：用封板膜封板后，置37℃温育30min，洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍。加酶：每孔加酶标试剂100μL，空白孔除外。温育：用封板膜封板后，置37℃温育30min。洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍。SN/T4346.8—2015
显色：每孔加人显色剂A、显色剂B各50μL，轻轻震荡混勾，37℃避光显色15min。j
测定：每孔加终止液50μL，轻轻震荡混匀，10min内测定结果。设定酶标仪波长于450nmk）
处，用空白孔调零后测定各孔A值。1
6.2.2.6
清洗、消毒洗板机：按洗板机内置程序分别采用蒸馏水、20%乙醇和75%乙醇进行清洗消毒，30min后，再用蒸馏水清洗。
结果判定
临界值计算：临界值=0.1十阴性对照组A值均值（阴性对照组A值低于0.05者以0.05计算）。阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A≤0.1。阳性对照的正常值范围：A≥0.50。阳性判定：样品A值≥临界值者为病毒IgM抗体阳性。阴性判定：样品A值<临界值者为病毒IgM抗体阴性。生物安全措施
《人间传染的病原微生物名录》规定，埃博拉病毒、马尔堡病毒等危害程度分类为第一类，所有相关的实验室操作应按照以下规定执行埃博拉病毒、马尔堡病毒培养和动物感染实验须在生物安全四级（BSL-4)实验室内进行；未经培养的埃博拉病毒、马尔堡病毒感染性材料的操作须在生物安全三级（BSL-3)实验室内进行，操作实验室应获得国家相关认可资质；埃博拉病毒、马尔堡病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全二级（BSL-2)实验室内进行；
埃博拉病毒、马尔堡病毒等感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814；其他要求按GB19489进行。
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