【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 鲜乳中抗生素残留检验

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 4789.27---2008
代替(B/T 4789.27—2003
食品卫生微生物学检验
鲜乳中抗生素残留检验
Microbiological examination of food hygiene-Examination of residue of antibiotics in fresh milk2008-11-21发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2009-03-01实施
GB/T 4789.27-2008
本标准修改采用了国际分析家学会（AOAC)AOAC982.18液体牛奶制品中的β乳胺抗生素定性的颜色反应试验》（AOAC Official Mcthocl 982. 18Bcta-lactam antibiotics in fluid milk products-Qualitative color reaction tests)作为第一法。本标准与AOAC982.18相比主娶区别如下：扩大适用范围为鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种（Bacillusstearotherinophitusvar.calidolactis)的抗生素的检验，也可用于复原乳、消毒灭菌乳、乳粉中抗生素的检测；一修改了试剂盒加营养片方法，真接将含有试验菌株芽胞的培养基制备在小试管内；一将“注：偶尔有特殊批次的试剂盒可能需要较长的温育时闻才能完全显色。如果.每隔10trin检查一次颜额色显示情况，并记录每个批号产品所需要的最适当的温育时间。（Note：Occasionally kits of a particular Lot No, may rcquire a longer incuhation tie for clor tofully develop, If .....Check color developmcnt at 1o min intervals and record optimum inru-bationtimerequitedforeachLatNa.）”程序修改为“如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30 min作最终观察\；
删除青酶素酶确证程序。
本标雅代替（1/T4789.27一2003&食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留量检验》。本标准与GB/T4789.27—2003相比主要修改如下：-标准名称修改为“食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验”；增加了第二法，将原标准的嗜热乳酸链球菌方法确定为第一法；增加了附录A“培养基和试剂”
本标推的附录A为规范性附录。
本标准出中华人民共和国卫生部提出并归口。本标由中华人民共和国生部负责解释。本标准负责起草单位：福建省疾病预防控制中心。本标准参加起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、中国检验检疫科学研究院、河南省疾病预防控制中心、潮北省疾病预防控制中心。本标推主要起草人：马群飞、郭云昌、李瑾、日卫、廖兴广、马代、田静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-GB 4789.27—1984,GB/T 4789.27 - 1994,G3/T 4789. 27---2003.1范围
食品卫生微生物学检验
鲜乳中抗生素残留检验
本标准规定了鲜乳中抗生素残留的检验方法。GB/T4789.27—2008
本标准的第法适用子鲜乳中能抑制嗜热链球菌（Streptorocctsthernophitus）的抗生素的检验；第二法适用于鲜乳中能抑制嗜热脂肪芽胞杆菌卡利德变种（Bacillusstecrothermophilusvar.catiluta-ctis)的抗生素的检验，也可用于复原乳、消毒火菌乳、乳粉中抗生素的检测。第一法嗜热链球菌抑制法
2原理
样品经过80℃杀菌后，添加嗜热链球菌菌液。培养一段时间后，嗜热链球菌开始增殖。这时候加入代谢底物2，3，5-氮化兰苯四氮唑（TTC），若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，嗜热链球菌将继续增殖，还原TTC成为红色物质。相反，如果样品中含有高于检测限的抑菌剂，则嗜热链球菌受到抑制，因此指示剂TTC不还原，保持原色。3设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1冰箱.2℃~5℃、20℃~—5℃
3. 2 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。3.3带盖恒温水浴锅：36℃士！℃,80℃±2℃。3.4天平：感量0.1g、0.001g。
3.5尤菌吸管：1mL(具0.01ml刻度）,10.0mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。无菌试答：18m×180mm。
温度:0 ℃~100 ℃。
旋祸混勾器。
菌种、培养基和试剂
菌种：嗜热链球菌。
灭菌脱脂乳:见第 A, 1 章。
4.34% 2、3，5-氯化兰苯四氮唑(TTC)水溶液：见第 A.2竞。4.4青素G参照液；见第 A.3章。5检验程序
鲜乳中抗生素残留验程序见图1。品成伴网h
GB/T 4789.27—2008
微红色
结果可疑,重新检测
样品mL
80 ℃+2℃,热5 min
冷却至37以下
加菌液，36℃=1水浴2h
加TTC指示剂，36℃+1水浴30min不显色
36 t±1 ℃水浴 3 min
不显色
抗生紊残留阳性
结果报告
抗生索残留阴性
图1鲜乳中抗生素残留检验流程图6操作步骤
6.1 活化菌种
取一接种环嗜热链球菌菌种,接种在 9 InL 灭菌脱脂乳中,置 36 ℃土1 C恒温培养箱中培养 12 h~15 h后,置2 ℃～5℃箱保存备用。每15 d转种一次。6.2测试菌液
将经过活化的嗜热链球菌菌种接种火菌脱脂乳，36℃士1℃培养15h士1h，加人相同体积的灭菌脱脂乳混匀稀释成为测试菌液。6.3培养
样品9ml,置18mm×180 mm试管内，每份样品另外做一份平行样。[向时再做阴性和阳性对2
http:
GB/T 4789.27—2008
照各：-份，阳性对照管用9mL青霉素G参照溶液，阴性对照管用9mL.火菌脱脂乳。所有试管置80℃士2℃水浴加热5min，冷却至37℃以下，加人测试菌液1mL，轻轻旋转试管混匀。36℃土1C水浴培养2h，加4%TTC水溶液0.3mL，在旋祸混勾器上混合15$或振动试管混匀。36℃±1℃水浴避光培养30min，观察颜色变化。如果颜色没有变化，于水浴中继续避光培养30min作最终观察，观察时要迅速，避免光照过久出现十扰。6.4判断方法
在白色景前观察，试管中样品呈乳的原色时，指示乳中有抗生素存在，为阳性结果。试管中样品呈红色为阴性结果，如最终观察现象仍为可，建议重新检测。7报告
最终观察时，样品变为红色，报告为抗生素残留阴性。样品依然呈乳的原色，报告为抗牛索残留性。
本方法检测儿种常见抗生素的最低检出限为：青霉素0.004IU，链需素0.5IU，庆人霉素0.4IU，卡那霉索 ５IU，
第二法嗜热脂肪芽胞杆菌抑制法8原理
培养基预先混合嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞，并含有pH指示剂（溴甲酚紫）。加入样品并孵育后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低丁检测限，细菌芽胞将在培养基中生长并利用糖产酸，PH指示剂的紫色变为黄色。相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽胞不会生长，PII指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。
9设备和材料
除微生物实验空常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃~-5 ℃。9. 1
恒温培养箱:36℃±1℃,56℃±1℃。9.2
恒温水浴锅：65℃±2℃,80℃±2℃。9.4
无菌吸管或100μL,200μL微量移液器及吸头。9.5
无菌试管：18mmX180mm.15mmX100mm.9.6
温度讨:0 ℃~100 ℃。
离心机：转速50001/min，
10菌种、培养基和试剂
10.1菌种：热脂肪芽胞杆菌卡利德变种。10.2无菌磷酸盐缓冲液：见第A.4章。10.3灭菌脱脂乳,见第A.1章。
10.4溴甲酚紫葡葡糖蛋白陈培养基:见第 A.5章。10.5青霉素G参照溶液：见第A.3章，11检验程序
样品中抗生素残留检验程序见图2。3
GB/T 4789.27—2008
其他颜色
结果可疑，
重新测试
12操作步骤
12.1芽胞悬液
菌种活化
制备芽胞被
芽腹悬液加人溴甲酚紫葡萄糖蛋白豚培养基加人样品100μ
65 ℃±2 C水浴 2. 5 h
65℃+2c水浴30 min
抗生素残留阳性
黄色/黄绿色
抗生素残留阴性
结果报告
图2样品检验流程图
将嗜热脂肪芽胞杆菌菌种划线移种于营养琼脂平-板表面，56℃士1℃培养24h后挑坡乳白色半透明圆形特征菌落，在营养琼脂平板上再次划线培养，56℃土1℃培养24h后转入36℃士1℃培养3 d~~4d,镜检芽胞产率达到95%以上时进行芽胞悬液的制备。每块平板用1mI.~3ml.无菌磷酸盐缓冲液洗脱培养基表面的菌答（如果使用克氏瓶，每瓶使用尤菌磷酸盐缓冲液10mL～20mL），将洗脱液5(000r/min离心15inin。取沉淀物加0.03mol/1.的菌磷酸盐缓冲液（pH7.2),制成10CFU/ml芽胞悬液置80℃:2℃恒温水浴中10min后，密防止水分蒸发，置2℃～5℃保存备用。1
http:
12.2测试培养基
GB/T4789.27-—2008
在浪甲酚紫葡萄糖蛋白陈培养基中加入适量芽胞悬液，混合均勾，使最终的芽胞浓度为8×105（FU/nL～2×105CFU/mL。混合芽胞悬液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白陈培养基分装小试管，每管200μL，密封防止水分蒸发。配制好的测试培养基可以在2℃~5℃保存6个月。12.3培养操作
吸取样品100L加人含有崇胞的测试培养基中，轻轻旋转试管混匀，每份检样做两份，另外再做阴性和阳性对照各-份，阳性对照管为100μL青素G参照溶液，阴性对照管为100aL无抗生素的脱脂乳。于65℃土2℃水浴培养2.5h，观察培养苯颜色的变化。如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30min作最终观察。
12.4判断方法
在白色背景前从侧面和底部观察小试管内培养基颜色。保持培养基原有的紫色为阳性结果，培养基变成黄色或黄绿色为阴性结果，颜色处于二者之间，为可疑结果，对于可结果应继续培养30min再进行最终观察。如果培养基颤色仍然处于黄色紫色之间，表示抗生素浓度接近方法的最低检出限，此时建议重新检测一次。
13报告
最终观察时，培养基依然保持原有的紫色，可以报告为抗生素残留阳性。培养基变为呈黄色或黄绿色时，可以报告为抗4:素残留阴性。本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素3μg/L.,链霉素50g/L，庆大霉素30μg/L，卡那需素50μg/L。
GB/T 4789.27—2008
A. 1 灭菌脱脂乳
A.1.1成分
无抗生素的脱脂乳。
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
经115℃灭菌20 min。也可采用无抗生素的脱脂乳粉，以蒸熘水10倍稀释，热至究全溶解，115℃灭菌20min
A,24% 2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)水溶液A,2.1成分
2,3,5-氯化兰苯四氮噬(TTC)
灭菌蒸馏馅水
A. 2.2制法
称取TTC,溶于灭菌蒸馏水中，装褐色瓶内于2℃～5℃保存。果溶液变为半透明的白色或淡褐色，则不能再用。临用时用火菌蒸馏水5倍稀释，成为4%水溶液。A.3宵霉素G参照溶液
A,3.1成分
青霉素G钾盐
无菌磷酸盐缓冲液
无抗生素的脱脂乳
A3.2制法
精密称取青露素 G钾盐标雄品,溶于无菌磷酸盘缓冲液中,使其浓度为 100 IC/mlL1 000 IU/ml。再将该溶液用灭菌的无抗生素的脱脂乳稀释至 0. 006 IU/mL,分装于无菌小试管中,密封备用,--20℃保存不超过6个月。
A,4无菌磷酸盐缓冲液
A4.1成分
磷酸二氢
磷酸二氢钾
蒸馏水
A. 4.2制法
1000mL
将上述成分混合，调节pH至7.3士0.1121℃高压灭菌20min。A5溴甲酚紫葡萄糖蛋白陈培养基A.5.1成分
蛋白陈
葡葡糖
全是球纯网
2%漠甲酚紫乙醇溶液
蒸馏水
A.5.2制法
1 000 mL
GB/T 4789.27-2008
在蒸馏水中加入蛋白陈、葡糖、琼脂，加热搅拌至完个溶解，调节pH至7.1士0.1.然后再加入漠甲酚紫乙醇溶澈，混勾后，115℃高压火菌30tnin。http://foodmate.netGB/T 4789.27-2008
华人民共和
国家标准
食品卫生微生物学检验
鲜乳中抗生素残留检验
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2009年3月第·版
印张0.75字数14千字
2009 年3月第一次印刷
书号：1550661-36228
定价14.00元
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