【SN商检标准】 螯虾瘟检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4348—2015
螯虾瘟检疫技术规范
Quarantineprotocolforcrayfishplague2015-12-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
全三连商
2016-07-01实施
发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4348—2015
本标准修改采用世界动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2014年版）的2.2.1，主要修改如下：
原文格式及内容顺序排版上作了调整，按照GB/T1.1一2009进行编写；-原文中“Diseaseinformation”内容经修改简缩后作为本标准附录A；删除了原文“4.2.Clinicalmethods”内容；原文4.3.1.2.3.1.普通PCR上游引物（B042）序列为5-GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTTCF-3'。该引物序列3末端有误。经与OIE参考实验室专家确认，正确的引物序列为5”GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTT-CT-3;一增加了实时荧光PCR方法Ct阅值的描述：对原文“7.Corroborativediagnosticcriteria”的表述形式进行了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院本标准主要起草人：贾鹏、史秀杰、王津津、于力、郑晓聪、何俊强、兰文升、刘、陈兵、王红英叶奕优。
1范围
螯虾瘟检疫技术规范
SN/T4348—2015
本标准规定了螯虾瘟的临床症状、病原分离、普通PCR和实时荧光PCR检测方法。本标准适用于螯虾瘟的诊断、流行病学调查和监测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，，仅注日期的版本适用于本文bzxZ.net
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求3概述
螯虾瘟（crayfishplague）是由Aphanomycesastaci感染士足目螯虾科和刺科螯虾的一种水生动物传染性疾病。A.astaci属于藻界（Chrom藻类（Diatoms和Brownalgae）。根据sta）、卵菌门（Oomycota）、卵菌纲（Oomycetes）、硅藻和褐aci对宿主的易感程度，检疫对象分为北美螯虾和高度易北美地区的所有种类螯虾，是A.astaci的自然携带者，被感螯虾两大类。北美螯虾是指野生或养殖于二感染后通常无临床症状或死亡。高度易感螯虾是指除北美螯虾外，对A.astaci易感且易出现临床症状或死亡的螯虾（参见附录A)。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ITS：核糖体DNA内转录间隔区（internaltranscribed spaa
ITSl：核糖体DNA内转录间隔区1(internaltranscribedspacer1）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）CTAB：十六烷基三甲基漠溴化胺（cetyltrimethylammoniumbromide）UNG：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase）Ct：循环阈值（cyclethreshold）5仪器和设备
5.1
倒置显微镜。
冷冻离心机。
5.2
5.3微量移液器。
PCR扩增仪。
5.4
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5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
5.10
实时荧光PCR仪。
水平电泳仪。
凝胶成像仪。
超净工作台。
恒温培养箱。
二级生物安全柜。
6试剂和材料
6.1
水：符合GB/T6682中一级水的规格。6.2
螯虾瘟菌株：由指定单位提供。6.3无水乙醇，分析纯，使用前预冷至一20℃。6.470%乙醇。
6.5
6.6
DNA聚合酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP。6.7
螯虾瘟普通PCR检测引物BO42/BO640：上游引物B042:5'-GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTT-CT-3'；下游引物B0640:5'-CTATCC-GAC-TCC-GCA-TTC-TG-3'；扩增A.astaciITS基因中大小为569bp片段。6.8螯虾瘟普通PCR复核引物TS1/TS4：上游引物TS1:5'-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GCG-G-3'；—下游引物TS4:5'-TCC-TCC-GCT-TAT-TGA-TAT-GC-3'；扩增A.astaciITS基因中大小为757bp片段6.9实时荧光PCR引物及探针：
上游引物AphAstITS-39F:5'-AAG-GCT-TGT-GCT-GGG-ATG-TT-3'；下游引物AphAstITS-97R：5'-CTT-CTT-GCG-AAA-CCT-TCT-GCT-A-3'；-探针：AphAstITS-60T:5\-6-FAM-TTC-GGG-ACG-ACC-CMG-BNF-Q-3';扩增A.astaciITS1基因中大小为59bp的片段。7临床症状
高度易感螯虾感染A.astaci后，失去正常厌光性，独自游动，失去平衡，腹部朝上且不易翻转。病虾透明软角质层下肌肉组织有白色和棕色坏死斑点，发病初期前腹部和足关节处变白。有时可见局部透明软表皮和肌肉组织有褐色黑化病灶，在病灶表皮上可见棕色菌丝向外延伸。北美螯虾感染A.astaci后，有时在其软角质层可见黑化病灶，但通常没有明显临床症状。8采样
样品包括活的、濒死的或死亡不超过24h的螯虾，采样数量按照GB/T18088规定执行，实验室检测条件应符合GB19489的规定。
在运送活样品时，需将样品置于通气、潮湿且温度低于16℃的容器中，24h内送达实验室。对于濒死的或24h内无法送达的样品，将其冷冻运输至实验室，待解冻后取靶器官组织，或将样品按体积比1：10固定于乙醇溶液（浓度高于70%）后送检，但只能用于普通PCR和实时荧光PCR方法检测。高2
度易感螯虾取其腹部软角质层，北美螯虾取其腹部角质层、腹足和尾节。9诊断方法
9.1病原分离
9.1.1病原培养
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无菌条件下，用蘸有无菌水的棉签或滤纸小心擦拭螯虾腹部软组织或其他可能被污染的部位。用无菌手术刀将易感部位、病灶的肌肉组织或角质层横切下来，置于含有双蒸水的培养血中轻轻漂洗后，将其切成3mm～5mm2的小块，置于IM培养基（见附录B中B.1)表面，用封口膜密封后置于16℃~24℃培养并逐日观察。
9.1.2孢子囊、初级游走孢子和次级游走孢子的诱导无菌条件下，取9.1.1中带有生长活力菌丝的一小团琼脂（直径约3mm~4mm），置于含有30mL灭菌池塘水（见B.2）的培养血。20℃培养12h～15h或者16℃培养20h～30h，倒置显微镜下观察。9.1.3结果判定
若观察到孢子囊、初级游走孢子或次级游走孢子，判定病原分离方法检测结果为阳性。9.2普通PCR方法
9.2.1设立对照
从提取DNA开始，每个步骤均需设立阳性对照、阴性对照、空白对照。取已知含有A.astaci的样品作为阳性对照，取已知无A.astaci的样品作为阴性对照，取等体积的水作为空白对照。9.2.2核酸抽提
螯虾组织和培养后的菌丝均可用于核酸提取。直接从螯虾组织中提取DNA核酸。无菌条件下，用蘸有无菌水的棉签清洗鳌虾体表，取螯虾易感组织30mg50mg，置于液氮研磨成粉状。将样品转入2mL离心管，加入900μLCTAB（见B.3），上下颠倒混匀，25℃作用2h。加人600μL抽提液I（见B.4），振荡混匀1min。12000r/min离心5min。取上层水相于新的离心管，加入700μuL抽提液Ⅱ（见B.5），上下颠倒混匀，12000r/min离心5min。取上层水相于新的离心管，加人1.5倍体积的预冷无水乙醇，上下颠倒混匀。一20℃沉淀2h或更长时间，12000r/min离心10min。弃上清液，于沉淀中加入75%乙醇溶液800uL，漂洗沉淀，12000r/min离心5min。弃上清液，将离心管倒置于滤纸上，室温干燥30min。向DNA沉淀中加50μLTE缓冲液（见B.6），一20℃保存备用。从培养后的菌丝中提取DNA核酸。无菌条件下，从琼脂培养基表面刮取少量菌丝，无需使用液氮研磨，直接抽提核酸，步骤同上。在实验过程中，可采用蛋白酶K消化裂解法或其他同等效果的商业化DNA抽提试剂盒代替以上方法。
9.2.3反应体系
普通PCR方法包括2对特异性引物，分别为BO42/BO640和TS1/TS4。其中，普通PCR检测首选BO42/BO64O引物，TS1/TS4引物仅用于阳性结果复核。3
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BO42/BO640引物和TS1/TS4引物的PCR反应体系相同。10×PCR缓冲液5uL，MgCl(25mmol/L)3μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上游引物（10μmoL/L）2.5μL，下游引物（10μmol/L）2.5μL，DNA聚合酶（5U/μL)0.25μL，模板DNA2μL，双蒸水补充总体积至50μL。瞬时离心后置于PCR扩增仪。
9.2.4反应条件
9.2.4.1使用Bo42/B0640引物时，普通PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环；72℃再延伸7min；4℃保存。9.2.4.2使用TS1/TS4引物时，普通PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环：72℃再延伸7min：4℃保存9.2.5琼脂糖凝胶电泳
用TBE电泳缓冲液（见B.7)配制1%的琼脂糖（含0.5μg/mL漠乙啶，见B.8）凝胶板。将其放人水平电泳槽，使电泳缓冲液盖过胶面。取5μLPCR产物和1μL6×上样缓冲液（见B.9）混匀后加人样品孔，5V/cm电泳约40min后，置于凝胶成像仪观察结果9.2.6结果判定
9.2.6.1阳性对照应扩增出大小为569bp或757bp的特异性条带，阴性对照和空白对照不能扩增出569bp或757bp的特异性条带。若对照不成立应重新实验。9.2.6.2被检样品未扩增出任何条带，或虽有条带，但大小不是569bp或757bp，则判定普通PCR方法检测结果为阴性。
9.2.6.3若被检样品扩增出大小为569bp或757bp的特异性条带，则判定普通PCR方法检测结果为阳性。
9.3实时荧光PCR方法
9.3.1设立对照
同9.2.1。
9.3.2核酸抽提
同9.2.2。
9.3.3反应体系
PCR预混液（见B.10)12.5μL，上游引物（10μmol/L)2.5μL，下游引物（10μmol/L)2.5μL，探针(10μmol/L)0.5μL,DNA模板5μL，双蒸水补充总体积至25μL。9.3.4反应条件
50℃5min激活UNG酶；95℃10min；95℃15s58℃60s，共50个循环。9.3.5结果判定
9.3.5.1阳性对照Ct值小于35，并有典型扩增曲线。阴性对照和空白对照无Ct值且无扩增曲线。若对照不成立应重新实验。
9.3.5.2被检样品无Ct值且无扩增曲线，或Ct值大于40，可判定为实时荧光PCR方法检测结果为阴4
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性。若被检样品Ct值小于35且有典型扩增曲线，可判定实时荧光PCR方法检测结果为阳性。9.3.5.3若被检样品Ct值大于35而小于40，应重新抽提核酸，调整实时荧光PCR反应的模板浓度后重新实验。重新实验后，若Ct值大于40则判定实时荧光PCR方法检测结果为阴性；若Ct值小于40则判定实时荧光PCR方法检测结果为阳性9.4PCR产物测序及分析
9.4.1普通PCR产物测序及分析
当B042/B0640引物扩增产物的测序结果与参考序列（参见附录C中C.1)同源性为100%，则判定为A.astaci基因序列。
当BO42/B0640引物扩增产物的测序结果与参考序列（见C.1）同源性低于100%，则需要使用TS1/TS4引物对该样品进行PCR复核。当TS1/TS4引物扩增产物的测序结果与参考序列（见C.2)相符，则判定为A.astaci基因序列。9.4.2实时荧光PCR产物测序及分析若实时荧光PCR产物测序结果与参考序列（参见C.3)相符，则判定为A.astaci基因序列。10综合判定
满足以下任何一条均可判定为鳌虾瘟阳性无论样品是何种螯虾，若普通PCR方A.astaci基因；
检测结果为阳性且测序结果表明PCR产物为PCR方法检测结果为阳性且测序结果表明PCR产物为无论样品是何种螯虾，若实时荧光A.astaci基因；
无论样品是何种螯虾，若病原分离方法检测结果为阳性，且普通PCR或实时荧光PCR对培养物检测结果为阳性；
高度易感螯虾出现临床症状或死亡，而同一水域其他甲壳类水生动物未出现临床症状或死亡，PCR方法检测结果为阳性；
且普通PCR或实时荧光
高度易感螯虾出现临床症状或死亡，且该国或地区曾经发生或被检出过螯虾瘟，且普通PCR或实时荧光PCR方法检测结果为阳性；，普通PCR或实时荧光PCR方法检测结果为阳性。样品为北美螯虾，无论鳌虾有无临床症状5
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附录A
（资料性附录）
整虾瘟
螯虾瘟（crayfishplague）是由Aphanomycesastaci感染螯虾（十足目螯虾科、刺科）的一种水生动物传染病。A.astaci属于藻界（Chromista）、卵菌门（Oomycota）、卵菌纲（Oomycetes）、硅藻和褐藻类(Diatoms和Brownalgae)。
螯虾瘟分布广泛。该病在德国、法国、俄罗斯、芬兰、英国、瑞典、以色列、土耳其、希腊、挪威均有报道，但新西兰和澳大利亚被OIE认定为螯虾瘟无疫国。该病流行有一定规律，主要沿法国和德国两个方向，通过多瑙河进人巴尔干地区，横跨德国北部平原进入俄罗斯再向南传播至黑海，或向西北传播至芬兰。1907年，该病传入瑞典，随后传人英国、以色列、土耳其、希腊和挪威，并造成巨大损失。1960年，西班牙首次暴发该病。2007年，英国养殖的土耳其小龙虾感染该病。另外，由于北美螯虾是A.astaci的易感宿主，所有种类北美螯虾均被认为有感染A，astaci的风险。多种螯虾对A.astaci易感。欧洲西北部的奥斯塔欧洲螯虾（Astacusastacus）、欧洲西部和西南部的白爪小龙虾（Austropotamobiusplaaipes）、欧洲西南部的巨石螯虾（Austropotamobiustorrentium）和土耳其小龙虾（Astacusleptodactylus）等品种对A，astaci高度易感。实验条件下，中华绒螯蟹（Erio-cheirsinensis）、澳大利亚种螯虾对A.astaci高度易感，死亡率达1oo%。北美螯虾是A.astaci的自然携带者，通常不表现临床症状或死亡。北美螯虾是指在北美地区养殖或野生的所有种类整虾，约有35o种。例如北美淡螯虾（Pacifastacusleniusculus）、克氏原螯虾（Procambarusclarkii）、叉肢螯虾(Orconectesspp.）等。因此，从北美地区或疫区进口螯虾过程中，将螯虾瘟病原引入我国的风险较高。OIE《水生动物疾病诊断手册》（2014年版）的2.2.1中规定了整虾瘟的临床症状、组织病理学、病原分离培养、普通PCR、实时荧光PCR、PCR产物测序技术。感染初期，在螯虾薄表皮透明区域下的肌肉组织初期会变白，并伴有褐色黑化病灶，特别是前腹部和足关节。感染中期，螯虾表现为活动范围缩小，失去正常庆厌光性，白天在开阔水域可见到病虾，运动不协调。感染后期，病虾几乎失去平衡，背朝下而死。但是，北美螯虾感染A，αstaci后，通常不表现任何临床症状，为螯虾临床检疫造成困难。因此，临床症状诊断方法具有很大局限性，不能对鳌虾瘟进行确诊。病原分离是检测螯虾瘟的方法之一，尤其普通PCR和实时荧光PCR方法未建立前，病原分离结合其他技术（例如感染试验和组织病例切片等）成为螯虾瘟检测的重要方法。当培养温度大于7℃时，A.astaci可在IM培养基表面生长成单个无色菌落，菌丝大小为5um～10μm，无隔膜。发育阶段的菌丝内含有大量粗糙颗粒状细胞质，折光率较强。中后期菌丝的细胞质边缘含有较大空泡，通过细的条状原生质与中央液泡相连接。后期菌丝表面相对光滑，没有任何物质，显微镜下可见游走孢子，可作为鉴定该病的重要参考。
由于仅参考临床症状或病原分离培养结果无法确诊螯虾瘟，普通PCR和实时荧光PCR结合基因测序成为确诊螯虾瘟相对有效、快速的方法。另外，螯虾瘟阳性判定不仅与样品临床症状、病原分离、普通PCR、实时荧光PCR和基因测序的检测结果密切相关，与样品的来源、样品种属分类、样品状态也有较大关系。
B.1IM培养基
琼脂
酵母提纯物
葡萄糖
恶喹酸（Oxolinicacid）
灭菌池塘水
12g
10mg
附录B
（规范性附录）
试剂及配方
1000mL
SN/T4348—2015
上述成分混合溶解，121℃高压灭菌20min，当冷却到40℃时加入浓度为1g/mL青霉素。无菌条件下，制备成平板培养基。
B.2灭菌池塘水
池塘水是指存在于自然界的河流或湖泊水，而不是去除矿物质的水。将池塘水用滤纸过滤后，加人2倍体积的无菌水，121℃高压火菌20min，调节pH至6～7。B.3CTAB溶液
NaCl
EDTA
Tris-HCl
超纯水
8.19g
0.744g
1.12g
60mL
充分混匀后，用盐酸调节溶液pH至7.5～8，加人十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)2g，充分搅拌溶解，用超纯水定容至终体积100mL。使用前加巯基乙醇至终浓度为0.25%。B.4
抽提液I
将Tris-HCI平衡酚与等体积三氯甲烷/异戊醇（24：1)混合均匀后，移人棕色玻璃瓶，4℃保存。B.5抽提液Ⅱ
即三氯甲烷/异戊醇溶液。将三氯甲烷和异戊醇按体积比24：1进行混合，移人棕色玻璃瓶，4℃保存。
B.6TE缓冲液（pH8）
1mol/LTris-HCI缓冲液（pH8)
0.5mol/LEDTA(pH8)
10mL
2mL
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