【国家标准(GB)】 牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22991—2008
牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of virginiamycin residue in bovine milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T22991-2008
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：宋文斌、李一尘、董振霖、隋凯、赵景红、薛大芳、张华一、李振荣、庞国芳。1范围
牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法
GB/T22991-2008
本标准规定了原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1（virginiamycinM1）残留量测定的液相色谱-申联质谱测定方法。
本标准适用于原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1残留量的测定。本标准的方法检出限：原料乳中维吉尼霉素Ml为0.25μg/L，纯奶粉中维吉尼霉素M1为2.0μg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1-2004ISO5725-1:1994,IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD）3原理
试样中残留的维吉尼霉素M1在甲醇十乙腈混合提取液中涡旋提取、离心、取上清液用磷酸二氢铵缓冲溶液稀释，于C1s固相萃取柱进行净化。将洗脱液中的维吉尼霉素M1用三氯甲烷分离萃取，去除水层。氮吹三氯甲烷至干，用甲酸铵缓冲溶液与甲醇混合液溶解并定容，供液相色谱-串联质谱仪测定。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙酸。
4.2甲酸：色谱纯。
4.3甲醇：色谱纯。
4.4乙睛：色谱纯。
4.5三氯甲烷：色谱纯。
磷酸二氢铵：优级纯。
4.7甲酸铵：优级纯。
磷酸二氢铵溶液：0.1mol/L，称取11.50g磷酸二氢铵（4.6)，用水溶解定容至1000mL。4.8码
4.9磷酸二氢铵溶液：0.01mol/L，量取0.1mol/L磷酸二氢铵溶液（4.8)100mL，用水稀释定容至1000mL
4.10甲酸铵缓冲液：0.12mol/L，pH=3.2，称取7.56g甲酸铵（4.7），用水溶解，用甲酸（4.2）调节pH到3.2，定容至1000mL。
4.11甲酸铵缓冲液：0.003mol/L，pH=3.2，量取25.0mL的甲酸铵缓冲液（4.10），用水稀释定容至1
GB/T22991—2008
1000mL
4.12甲醇+乙腈溶液(1+1)。
4.13水+乙腈溶液（4+1)。
4.14水十甲醇溶液（13+7)。
4.15水十甲醇溶液（9十11)。
4.16流动相A：0.003mol/L甲酸铵缓冲液（4.11)用0.2μm滤膜过滤。流动相B：甲醇十乙腈溶液（1十1)（4.12)用0.2um滤膜过滤。4.17标准物质：维吉尼霉素M1（CAS：21411-53-0），纯度95%。4.18标准储备溶液：0.1mg/mL。准确称取适量的维吉尼霉素M1标准物质，用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备溶液。该溶液在4℃保存。注：称取标准物的质量是按纯度修正过的质量。4.19标准工作溶液：根据维吉尼霉素M1的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配成不同浓度的标准工作溶液。标准工作溶液在4℃保存。5仪器
5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5.2离心机：最大转速为10000r/min。5.3离心管：锥形底玻璃离心管40mL、15mL和10mL，具塞；锥形底聚内烯离心管50mL具螺旋盖。5.4电子天平：感量0.1mg和0.1g。5.5过滤器：聚四氟乙烯膜过滤器：0.22μm×13mm；尼龙膜过滤器：0.22μm×47mm。5.6移液器：量程为1mL~10mL和5mL~50mL。5.7微量加液器：量程为10μ~100μ，100μ~1000μ。5.8
流动相过滤装置。
5.9氮气浓缩仪。
高速涡流混合器。
振荡器。
酸度计：精确度为士0.02。
超声波仪。
一次性注射器：1mL。
固相萃取柱：BondElutC8，500mg，柱长为6mL。鸡心瓶：150mL。
贮液器：100mL。
试样瓶：2mL。
一次性移液管。
5.20滤纸。
试样的制备与保存
试样的制备
将原料乳和纯奶粉样品分别混合均匀。各自分出0.5kg作为试样，将分出的试样密封，并作上标记。
6.2试样保存
将试样置于4℃条件下贮存。
7测定步骤
7.1提取
7.1.1原料乳样品
GB/T22991—2008
称取原料乳5.00mL，精确到0.01mL，放人50mL聚丙烯离心管中，加入10mL的甲醇十乙睛溶液（1十1)涡旋1min，高速振荡10min，离心15min（5000r/min），将上清液转移至40mL离心管中。再向残渣中加人2mL甲醇十乙睛溶液（1十1）涡旋5s，高速振荡5min，在5000r/min下离心10min。合并两次上清液与40mL离心管中。加人15mL的0.01mol/L磷酸二氢铵溶液（4.9），高速振荡5min，以5000r/min离心10min，用滤纸过滤至150mL的鸡心瓶中，加人80mL磷酸二氢铵缓冲液(4.9)混匀待净化。
7.1.2纯奶粉样品
称取纯奶粉0.625g，精确到0.001g，放50mL聚丙烯离心管中加水4375g，超声溶解得到复原乳。加入10mL的甲醇+乙睛溶液（1十1）涡旋1min，以下步骤同原料乳样品。7.2净化
依次用5mL乙腈、5mL水和5mL的磷酸二氢铵（4.9）洗涤活化固相萃取柱（5.15）。在柱上装上贮液器（5.17），将样液（7.1)过柱，移去贮液器（5.17）。依次用2mL水，10mL水十乙溶液（4十1），2mL水和10mL水十甲醇溶液（13+7）洗柱，弃去全部流出液。最后用5mL水十甲醇溶液（9+11)洗涤维吉尼霉素M1，收集洗脱液到15mL的玻璃离心管中。将10mL三氯甲烷（4.5）加入洗脱液中，振荡5min，离心10min（5000r/min）。用一次性移液管定量收集三氯甲烷层到10mL离心管中，在40℃条件下氮吹至干。再向离心管中加入500μL甲醇，超声5min，加人500μL甲酸铵缓冲液（4.11），高速涡旋5s。样液用0.2μm的滤膜过滤到样品瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.3色谱测定
7.3.1液相色谱条件
液相色谱条件如下：
a）色谱柱：SunFireCig，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）
柱温：40℃；
进样量：30μL；
d）色谱柱总流量：300μL/min；e)
流动相及梯度见表1。
表1流动相及梯度
时间/min
7.3.2质谱条件
质谱条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应检测；
d）电喷雾电压（IS)：5000V；
e）雾化气压力(CAS1)：517.1kPa；流动相A/%
流动相B/%
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气帘气压力（CUR）：103.4kPa；f)
辅助气压力（CAS2)：620.5kPa；h)
离子源温度（TEM)：700℃；
定性离子对、定量离子对，采集时间（Dwell），去簇电压（DP）、碰撞气能量（CE）、人口电压i)
(EP)，及碰撞室出口电压(CXP)见表2。表2维吉尼霉素M1的质谱参数
定性离子对(m/2z）
526.3/336.9
526.3/355.1
526.3/508.4
定量离子对(m/z）
526.3/336.9
7.3.3液相色谱-串联质谱测定
7.3.3.1定性测定
去簇电压/V
采集时间/ms
碰撞气能量/VbZxz.net
人口电压/V
出口电压/V
按照液相色谱-串联质谱测定条件进行样品溶液测定。如果检出的色谱峰的保留时间与基质标准中物质相一致，并且所选择的离子均出现，选择1个母离子和2个以上子离子，样品谱图中组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许的最大偏差
7.3.3.2定量测定
2010K≤10
用标准工作溶液（4.19)分别进样，以峰面积为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中维吉尼霉素M1的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述的色谱条件和质谱条件下，维吉尼霉素M1的参考保留时间为24.28min。维吉尼霉素M1的标准总离子流图参见附录A。维吉尼霉素M1的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B。7.4平行试验
按照以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.5空白试验
空白样品中添加标准溶液按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算
试样中维吉尼霉素M1残留量利用数据处理系统计算或按式（1)计算：Vy1000
×1000
式中：
X-试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg)；-从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V
一样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）：样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。m
计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
（1）
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的4
值是以95%的可信度来计算。
9.2重复性
GB/T22991-2008
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4添加浓度范围及重复性和再现性方程样品基质
原料乳
纯奶粉
添加浓度范围
0.25~2.00
注：m为两次测定结果的算术平均值重复性限r
lgr=0.894lgm-0.666
Igr=0.532lgm+0.111
单位为微克每千克
再现性限R
lgR=2.268lgm+0.273
lgR=0.685lgm+0.086
如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2
再现性
在线性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1的添加浓度范围及再现性方程见表4。GB/T22991—2008
附录A
（资料性附录）
标准物质总离子流图
维吉尼霉素M1标准物质总离子流图，见图A.1。4.8e4
维吉尼霉素M1标准物质总离子流图26
附录B
（资料性附录）
维吉尼霉素M1添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B.1表B.1维吉尼霉素M1添加浓度及其平均回收率的试验数据样品基质
原料乳
纯奶粉
添加浓度/(μg/kg）
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平均回收率/%
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