【商检行业标准(SN)】 进出口食品中赭曲霉毒素A的测定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1940--2007
进出口食品中赭曲霉毒素A的测定方法Determination of ochratoxin A in foods for import and export2007-08-06发布
中华人民和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-03-01实施
本株雅的附录A为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T19402007
本标准起草单位：中华人民共和国土海出人境检验检疫局、北京中检维康技术有限公司、上海博尼生物科技有限公司。
本标滩主要起草人庆华,郭德华,王敏、干雄、沈建英。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围
进出口食品中赭曲霉毒素A的定方法SN/r1940--2007
本标准规定了免疫亲和杜层析净化高效波和色造法和炭光光度法测定食品中精山密毒素人的方法。
木标准仰裁法适用于小麦大麦、玉米、葡萄消.黄酒、啤酒、葡背于、胡椒粒/粉中猪弗霖粉素A的测淀
本标淮快速法适用于小麦、大麦，玉米、白葡黏酒，黄酒、酒、葡药干、白胡粒/粉中精山霖萨紫A的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标推的引用成为末标准前系款。几是社口期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括助误的内容）或修改版均不适用于本标据，然预，效励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注！期的引用文作其最新版本适用于本标难。GB/T6682分析实验室用水规格和微验方法GB/T18979食品中费曲舞毒素的满定免疫豪热折数液相色谱法和荧光光度法SN/T 0800.1进出口粮油，饲料捡验抽样和制样方奖SN/0961进出口箱错于检验势
3样品制备
3.1样品数量
3.1.1小友大麦玉米：原始样品数罐热不沙4kE·按照SN/T080.1的规定缩分至1kg作为试验样品。
3.1.2胡极粒/粉、葡精干：样品数起不少了1g3.1.3葡菊酒、黄酒、啤酒，样品不州于10g0ml3.2样品制备
3.2.1小麦、大麦、下米、胡板粒：以粉碎机<4.3.2)余部粉碎斯道过1m圆孔筛。粉降试样暨于广口瓶中滤句备用并标明标记。
3.2.2筛下，按照SN/T0961的规延剃备。粉碎试样置于口瓶中混各用并标明标记。3.2.3噢酒：使用前罩-0℃～4℃冰箱冷藏了1，启盖，倒人锥形瓶中在振荡器（4.3.3)上振搭至泡沫消失。以塑料薄膜封口备用并标明标记。3.2.4试样在制备过程中，应防止样品受到污染。4免疫亲和柱层析净化高效液相色谱法（仲裁法）4.1方法提要
试样经过甲醇一水灌液或碳酸氢钠泽液提取，提收液经过滋，稀释后，滤液经过含有释曲舞毒素A特异抗体的免疫亲和柱层析净化，以甲醇洗脱，洗脱教供有荧光检测器的高效液相色谢仪测延，外标法定量。
4.2试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应行合（E3/T6682中二级用水要求。1
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4.2.1 甲醇;HIIC级。
4.2.2聚乙二醇(polycthylenc glycol.分子ll 8000)。4.2.3氯化钠。
4.2.4碳酸氨钠，免费标准下载网bzxz
4.2.5磷酸氢二钠。
磷酸一氢钾。
氧化卵。
浓盐酸。
4. 2. 9吐温-20(Tweet 20)
4.2. 10乙脂:HPLC级.
4.2.11 磷酸钠。
-六烷苯三甲基漠化楼(C-talu)。4.2. 13
甲醇+水(8一2): 80 mI, 醇(4. 2. 120 ml.水4.2.14聚乙二醇-碳酸氢钠浓液：溶解10g聚乙二醇（4.2.2）、50g磁酸氢钠（4.2.4）于约950ml.水中,并用水释到1I
4.2. 15碳酸氢钠溶液:称取1碳酸氢钠(4.2.4),用水溶解并稀释到100 mL-。4. 2. 16氯化钠碳酸氢钠溶液：溶解25 g氯化钠(1. 2. 3),5 g磁酸氢钠(1.2. 4)丁约 950 ml.水中,并用水稀释到1I.
4.2.17磷酸绥冲落液（PBS)：称取8.0g氛化钠(4.2.3)、1.2g磷酸氢二钠（4.2.5)0.2g磷酸二氢钾(4. 2. 6)和 0. 2 g氯化钾(4. 2. 7)溶解于约900 trL水中,用盐酸(4.2. 8)调节 pI至7. 0.用水稀释至1L。
4.2.18淋洗缓冲液A：称取25g化（4.2.3)、5g碳酸氢钠（4.2.4)溶干水中，加人0.1mL吐温-20(4.2.9).届水箍释至1 L
4.2. 19淋洗缓冲较B:在 1 000 mI, 磷酸缓冲溶液(4. 2. 17)叫加入 1. 0 ml. 叶温 20(4.2. 9)。4.2.20磷酸钠溶液：0.012mo1/1.,调节pH至7.5。精的霍寿素A标证品：纯度大于99%。4.2.21
粘帕霍毒素A标准储备济液：用甲醇（4.2.1)配制0.100)mg/mI.的薪曲穿毒素A标准储备4.2.22
液.保存于4℃冰箱备用。
4.2.23精监荐素A标准工像溶液：准确移政适量的曲垂群素A标冻储备液（4. 2. 21),用甲醇(4.2.1)稀释成标准工作释被。
猪小霉素A免疫亲和柱。
碘纹折叠滤纸，无荧光持性。
玻璃纤维滤纸：直径11 cm,礼径1,5um,无荧光特性。4. 2. 27
玻试管，无荧光特性。
4.3仪器设备
4.3.1高效液相色谱仪，带荧光检测器。4.3.2粉碎机或相当的设备。
4.3.3水平方向振菌器，回转式或往复式。4.3.4高速均质器：18 000 r/nmin～220001/min,或捐当的设备。4.3.5台式离心机，最大转速不低于4009 r/min。4.3.6玻璃注射器：10mL。
4. 3. 7空气F泵。
4. 3.8微量进样器:100 μL-
4.4分析步骤
4.4.１捉取
4.4. 1. 1小麦,大麦,玉米
SN/T 1940--2007
称取粉碎试样50（准确列0.1g）下均质器配置的搅拌杯中，加人5.0g氯化钠（4.2.3)和5.0璨乙二醇（4. 2.2)，人100 ml 甲醇二水（8-2)(4. 2. 13)。将搅排杯置均器（4. 3. 4)上.于22000r/min高速搅拌提取1min。提取没经滤纸（4.2.25)过滤于干净的烧杯中，准确移取10mL滤液并圳人10mL.水稀释，混合均勾，经玻璃红维滤纸(4.2.26)过滤得到样品提坂液备用。4.4.1.2葡葡酒、啤酒、黄酒
准碰移取混匀的试样10ml.于100mL烧杯中，加人10ml.聚乙二醇十碳酸就钠落液（1.2.14），用玻璃捧搅排均匀，经玻璃纤维涨红(4.2.26)过滤得到拌品提取液衔用。4.4,1.3葡萄干
称取粉碎试样 50 书（准确到0.1 g）于均质端配置的揽拌杯中，加人 100 InL 碳磁氢钩榕（4.2.15）.将搅拌杯置于均质器（4.3.4）.:于22000r/min高速揽拌提取1min。提取瘦经滤纸（4.2.24)过滤。准确移取10mL滤液并加人40tml，淋洗缓冲没以1.2.10）稀释，经玻璃纤维滤纸（4.2.26)过滤得到样品捉取液备开。4.4.1.4胡椒粒/粉
称取泥勾试样25g（准确到0.1g）于均质端配罩的搅排杯中，加入100mL碳酸氢钠游液(4.2.15),将搅杯于均质器(4. 3.4）上以22 000 r/min 高速搅拌提取1 min。将提取物置下200 ml,离心杯中于4 000 r/min离心15 min(4.3.5)。准确移取 20 ml 滤没洋加人30 ml 淋洗綫冲液B3（4.2.19)稀释，经玻璃纤维滤纸(4.2.25)过滤得到样品摄瑕被备用。4. 4.2萨化
4. 4.2. 1小麦、大麦、下米
将免疫和杜（4. 2. 24)连接于 10 mI.玻璃注射器（4.3.6)下。雅确移取 10 ml. 样品提取液（4.4.1.1)于玻璃注射器（4.3,6)中将实气压力泵（4.3.7)与玻璃注射器相连接.调节丘力使溶液以约6ml/min流速缓慢道过免疫亲和住，直至2ml.~3ml.空气通过免疫亲和往。以10mL渐洗缓冲液A(4.2. 18）、10 mL水先后淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，非使2mL~3ml空气通过免疫亲和柱。准确加t人1.0mI.甲醇（4.2.1)洗脱.速为1mL/rin～2ml,/min。收集全部洗脱液于玻璃试管(4.2. 27)中。
4.4.2.2葡萄洒、啤洒、黄酒
将免疫亲和柱（4. 2.21)连接于 10 tml.玻璃注射器（4.3.6)下：推移取 10 ml.样品提取液（4.4.1.2)于玻璃法射器中，将空气压力象（4.3.7）与玻璃注射器相连接，调节压力使溶凌以约6ml./min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2mL～3mL空气通过免疫亲和住。以：mil.氯化钠-碳酸氢钠济液(4.2.16）,5 rml.水先后淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出获，片使2mL~3ml空气通过免疫亲和柱。准确期人1.0mL于醇（4.2.1)洗脱，流速为1iul/rmin~2ml./min。收集全部洗脱液于玻璃试管(4, 2, 27)中
4.4.2.3葡萄于
将免疫亲孤柱（4.2.24)连接干10mL坡璃注射器（4.3.6)下。准确移取10mL样品提取液（4.4.1.3)于玻璃注射器中，将气压力系（4.3-7）与玻鹅注射器和连接，调节压力他游液以约5ml./min流速级慢通过免疫亲和杜，百至2ml~3ml空气通过免疫亲和。以10ml.淋洗缓冲激B（4.2.19）、101m1.水先后淋洗免疫亲和柱，以下操作与4.4.2.1中，从弃去全部流出液...\以后部分机间。
4.4.2.4胡椒拉/粉
将免疫亲和柱（4.2.24）连接于10ml.玻璃注射器（4.3.6）下。推确移瑕10InL样品提取没3
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(4.4.1.1)于玻璃注射器巾，以下操作与4.4.2.3中\将定压力系(4.3.7)与玻璃注射器相连接+以盾部分相问。
4. 4.3测定
4.4.3.1离效液相色谱参考条作
色详柱：Ce柱<柱长150mm，内径3.0mm.填料直径5μm）。流动相：艺腊十磷酸钠液（60十40）.加入1g/I。十六烷三甲基漠化铵。流速，0.8ml./min。
炭光检测器：避发波长360nI1,发射波长110nm。耗湿：30℃。
进样骨：20 l.．
4.4.3.2定最测定
用微进样器（4.3.8）吸取等体机的帮等毒索A标准作溶液（4.2.22）和样品洗脱溶液（4.4.3)鑫插进样，在上述色讲繁件下测定标滩溶液和样品洗脱密披的响应值（峰高或峰而积），得到薪曲舞毒素A标准液和样品洗脱溶液高效液相色谱图，经过与粘通氧鞋案A标雅落液谱图比较响应位得到试样巾中者两获存素人的我度。避图参见时京A，4. 4. 4空自试验
除不加试样外，按上述步骚进行4.4. 5结果计算
样品中格曲霉萨素A的含按式（1）式（2)计算：其中：
nt 或
式中：
A的质轻分数的数道，应为微克弹下克（g/kg)或微克每升（ug/l），推棉中格首舒森#
选样中西需藏素A的谦度的筑.单位为微克！L）最终甲醇洗脱液体积的数值，单位为毫升（mL)：最终净化洗脱液断含的乱样质症或体积的数值单位克（g）或毫升（ml）：试样称取的质基肺数慎，单位为克(g)酒类试样移取的体积的数值，单位为塞升（m.）移取样品您液的体秋能数值，单位为毫升（m），通过免疫亲和的稀释后样战提敢液的体积的数值，单位为毫升（mL）：样品和提取液总体积的数值，单位为毫升（mL）：用于稀释滤液的体积的数值,单位为毫升(ml.)。注：测定结果须扣除白慎。
5测定低限,回收率
5. 1 测定低限
免亲和柱层析净化高效液相色谱法测定大麦、小发，下米、葡萄酒、黄酒，啤酒、筋简下和切椒粒/粉中精曲等素A的测定低限均为1\g/kg（或μg/L)5.2回收率
大麦、小麦、主米、酒、黄洒、啤酒、葡霸下和胡椒粒/粉中印霜紫人添加浓度及其回收率实验数据如下：
5. 2.1 大老见表 1。
添加浓度/(μR/kg）
小麦见表2。
添加法度（g/）
玉米见表3。
漆加浓度/（ug/）
5.2. 4啤酒见表 4,
淤加铱度
5. 2. 5 白葡萄酒见表 5 。
添如浓度/<(μg/L)
5. 2. 6 红简粘酒见表6。
淤加浓度/(g/L)
回收率/%
91.0~112. 0
74. 4-80. 6
78. 5 91. 2
76. 1 ~88. 3
同收率/%
99.0~103.0
75.2~90. 6
79, 4~91. 6
75. 6 93. 3
回收率/%
80.0~116.0
89.8~～105,1
80. 5 ~ 99, 7
回收率/%
91.c--113.0
97.1 1c0. 8
84. 5 --95. 6
回妆率/99
72.0~-87.0
79. 0-~95. 0
77. 8~87. 4
间收率/%
68. 0-~82. 0
92, 0~97.0
82. 5--93.8
SN/T 1940—2007
SN/T1940—2007
黄酒见表7。
添加浓度/(μg/L>
葡萄干见表8。
加浓度/（g/kg）
胡嵌粒/粉见表9。
滋加浓度/(μg/kg）
黑胡极粉见表10。
添加浓度/（μg/kg）
6免疫亲和柱层析净化荧光光度法(快速法）6.1方法提要
回收率/%
71. 0~~82, c
75.793. 4
82.8~88.2
回收率/%
71. 0~100. 0
80, 2 -- 93. 4
83. 3~~92. 3
回收率/%
69.0-87.0
70. 0-~94, 4
74. 2~84.7
回收率/%
74. 0 --100. 0
69.9~-90.9
70. 4~ 95. 5
试样经过甲醇十水游液或碳酸氢钠溶液提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有赭曲群毒素A特异抗体的免疫亲和柱层析净化，以氢氧化钠稀游液洗脱，洗脱通过荧光光度计测定。6. 2 试剂和材料
除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为重蒸水，6.2. 1甲醇: HPI.C级。
聚乙二醇(polyethylcnc glyrul,分子量 8000).6.2.3
氯化钠。
碳酸氢钠。
磷酸氢二。
磷酸一氯钾。
氯化钾。
浓盐酸。
6.2.9氢氧化销。
6.2. 10吡-20(Tween-20)。
6.2. 11硫酸。
6. 2. 12硫酸李宁(C. IzN,0. H,SO, 2H.0)。6. 2. 13 甲醇+水(8+2):收 80 ml. 甲醇(6. 2. 1)加: 20 mL 水。SN/T1940—2007
6.2.14聚乙二醇-炭酸氢钠溶液：溶解10g聚乙二醇（6.2.2)、50k碳酸氢钠（G.2.4）丁约950mL水中,并用水稀释到1 L
6.2.15碳酸氢钠溶液：称取1g碳酸氢钠（G.2.4).用水溶解并段释到100mI.。6.2.16磷酸缓种游液(PBS)：称取8.0g氯化钠(6.2.3),1.2g磷酸氢二钠(G,2.5)、0.2g磷酸二氢卵(6. 2. 6)和 0. 2 8氯化钾(6. 2. 7)溶解于约 900 ml,水小,用激盐酸(6. 2. 8)调节 pH 至 7. 0,用水稀释室［f.。
6.2. 17淋洗缓冲液A：称取25 g化钠(6.2.3),5 g曦酸氧钠(6.2.4)溶于水中，加人0,1 ml肚温-20(6.2. 10),用水稀释至 1 1
6.2.18淋洗缓冲液B在100DmL磷酸缓冲溶液（PBS)(6.2.16)加人1.0ml.吐温-20(6.2.10)。6.2.19氧氧化钢溶液（0.1mo1/L)：称取0.4名氧氧化钠（6.2.9)溶解于100mI.水巾，6.2.20硫酸溶液（0.05mo1/L),取2.8ml.浓硫酸（6.2.11).级慢加人适量水中，冷却后定容至1(00mi
6.2.21荧光光度计校准溶液：称取3.40g硫酸奎宁（6.2.12），用劲酸溶液（6.2.20)矫释至100mL，此液的荧光光度读数指当于36。6.2. 22黏曲辨毒素 A 免疫亲和柱。6.2.23槽纹折叠滤纸，无荧光特作。6.2.24坡璃纤维滤纸:直径11 cm,孔径1.5 μum,死荧光特性。6.2.25玻璃试管：点径12mm，长75m，无荧光特性。6.3仪器设备
6.3.1荧光光度计，VICAM。
6.3.2粉碎机或相当的设备。
6.3.3水平方向振荡器，担转式或往复式。6.3.4高速均质器：18000z/min~22000/min或相当的设备，6.3.5台式离心机，最大转速不低于4000r/min6.3.6玻聘注射器，l0mL.
6.3.7空气压力泵。
6.4分析步骤
6,4.1提取
6.4.1.1小麦大麦、玉米
间 4.4.1.1.
6.4.1.2白萄酒啤酒、黄酒
准确移取混勾试样50mL于均质器配置的搅拌杯中，加人50ml.碳酸氢钠溶液（6.2.15），将搅押杯置于均质器（6.3.4）上，于22Q00r/min高速搅拌提取1mirl准确移取10.0ml.并加人40.0ml.纯水稀释，用玻璃纤维滤纸（6.2.24)直接过滤人10ml.注射器（6.3.6)。6.4.1.3荷干
同 4. 4, 1. 3,
6.4.1.4白胡椒粉
间 4. 4. 1.4。
SN/T 1940—2007
6. 4. 2净化
6.4.2.1小麦、火麦、玉米
同4.4.2.1操作至\以10ml.淋洗缓冲液A(1.2.17)、10mL水先后淋洗免疫亲和柱去全部流出液，并使21ml～3mT.牢气通过免疫亲和柱。为止，推确划人1.5ml.氧氧化钠(6.2.19)洗脱，流速为lmL/min~2mL/min。收集全部洗脱没于玻璃试管(6.2.25)中。6.4.2.2山筋鹤酒、啤酒、黄酒
将免疫亲和柱（6.2.22)连接于10ml.玻璃注射端（6.3.6）下。准确移取10ml.样品提取液（6.4.1.2)于玻璃注射器中将空气压力浆（6.3.7）与玻璃法射器相连接.调节压力使溶液以约6mL/min流速缓橙通过免疫亲和柱，直至2ml～3mI.空允通过免疫亲和柱。以10ml淋洗缓冲液A（6.2.17）、10ml.水先后淋洗免疫亲和任，弃去全部流出液，并使2mL～3ml.空气通过免疫亲和杜。准确加人1.5ml.氢氧化钠（6.2.19）洗脱，流速为1mL/min～2mL/min。收集企部洗脱液于玻璃试管(6. 2. 25)
6.4.2.3葡萄干
同1.4.2.3操作至以10m淋洗缓冲液（4.219）、10前水拍后淋洗免疫亲和柱，齐去全都流出液，并使2mL～3mL空气通过究疫系和社：为止准痛加火mL氢氧化钠(6.2. 19）选脱，流速为1mI/min～2mI./min。收集全部洗脱液于玻喝试管（a.2中。6.4.2.4白胡椒粒/粉
向1.4.2.4操作至~以10ml.淋造缓冲液15)、10mL水先后淋洗免疫亲和社，弃去全部流出液.并使 2 ml.3 mL空气通过免疫亲和耗滤确期ml 氢氧低钠(6,2.9)洗脱流速为|mL/imin~2mL/min。收集季部选脱宇玻培试管5.f
6,4,3测定
6.4.3.1荧光光度计仪器条件
激发波长360nm.发射波长440nm
6.4.3.2荧光光度计校准
以硫酸溶液(6.2.20)为空白调零，以疏光光升校滩溶液(（6）进行校准。
6.4.3.3定量测定
将6.4.2部分的洗脱液立即置于荧光光度中读取样微小精谢等择素A的浓度。6.4.4 空白试验
除不加试样外，按上述乐骤行。6.4.5结果计算
样品中薪的毒素A的含量按式
式中：
(3式(4)计算
w=拟或
×v+×
（3）
X:——样品中出霖毒素A的质量分数的数值：单位为微克衔千克(μg/kg)或微克每升(ug/I.);荧光光度计读取试样中出露群素A的浓度的数值，单位为微克每升（pg/L）：V-一最终甲醇洗脱液休积的数值，单位为毫升(mL)；W—一最终净化洗脱液所含的试群质射的数值，单位为克（g)或弦升(ml.)：m--试样称取的质量的数值，单位为克（g);V—一酒奖试样我取的体积的数值，单位为套升（mL)：8
V,-----移取样品滤液的体积的数值,单位为毫升(mL);一通过免疫亲和柱的稀释后样品提取液的体积的数值，单位为儿(mI)：——样品和是取液总体积的数值,单位为毫升(mL);V
用于稀样滤液的休积的数值，学位为毫升（mL）注：仙定结果须打除空门值，
7测定低限、回收率
7.1测定低限
SN/T 1940--2007
免疫亲和村层析净化炭光光度法测定大友、小友、下米、白蓄萄酒、黄酒、哮酒、葡码干和白胡椒粒/粉宁曲霉毒素A的测定低限均为 1 μg/kg(或μg/l.)。7.2回收率
大麦、小去、玉米.凹葡酒、黄酒啤酒葡萄平和产傲粒/粉虫黏曲零毒素A添加浓度及其同收率实验数据如下：
7.2.1大麦表11。
添加浓度/（/kg）
小麦见表12。
添加浓度/(μg/kg)
7.2.3坐米见表13。
添加浓度（gg）
7.2.4啤酒见表14。
添加浓度/（ug/L）
回收率/号
70--80
93--110
56~-104
回收率/5
83--110
$1~104
回收率/%
80-~120
70:~98
回收率/%
70~110
1G0-110
SN/T 1940—2007
7.2.5白葡费酒见表15。
添加浓度/g/L)
黄酒见表16。
器加浓度/《μg/L)
葡萄于见丧 17。
添加浓度/《/g）
7.2.8白胡椒粒/粉见表18。
添如浓度/（μg/kg）
回收率/归
90-~110
回收率/5%
90--112
回收率7%
70--80
间收率/%
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